1、口腔疾病分子生物学 分子生物学是研究生物分子的特征、相互关系及其对生命活动影响的学科，分子生物学在医学中的应用有助于从根本上理解生物的生理及病理机制与过程。口腔疾病分子生物学Molecular biology of oral diseases 内容第一节 分子生物学基础一、概述二、基因三、基因表达四、基因表达的调节第二节 分子生物学研究的主要方法一、分子克隆的材料与方法二、分子克隆的主要步骤三、特异核酸的检测第三节 牙发生的分子机制一、釉质形成的分子机制二、牙本质形成的分子机制第四节 分子生物学在口腔致病菌研究中的应用一、变形链球菌属致龋毒力因子二、核酸杂交法检测牙周病相关细菌三、基于16S
2、rRNA基因分析的口腔微生物分类 与鉴定第五节 口腔病分子生物学基础一、遗传疾病的分类二、单基因遗传病研究中的几个概念三、基因多态性与突变第六节 口腔肿瘤分子生物学一、细胞增值与细胞凋亡二、口腔肿瘤发生的分子机制三、口腔肿瘤转移的分子机制四、口腔肿瘤相关基因的筛选与功能研究策略了解掌握熟悉分子生物学研究的主要方法与原理The Methods and Principles 牙发生中的分子机制以及口腔常见致病菌的毒力因子及检测方法Molecular Mechanisms of tooth development理解分子改变所导致遗传病的原理How can gene mutations affect
3、 health and development?基因的基本结构、功能及表达的调节The gene structure,function and expression第一节 分子生物学基础 概述 基因的基本结构和功能 基因表达 基因表达的调节 基因的基本结构和功能The Structure and functions of the nucleic acids Molecule(Gene)核酸 nucleic acidsJohannes Friedrich MiescherSwiss physician and biologist 1844-1895 He was the first resear
4、cher to isolate and identify nucleic acid.Discoverer of the structure of DNAThey were awarded the 1962 Nobel Prize for Physiology or Medicine,for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living materia.James Dewey Watson 1
5、928,AmericanMaurice Hugh Frederick Wilkins 1916,New ZealandX-ray diffractionFrancis Harry Compton Crick1916,British核糖核酸脱氧核糖核酸腺嘌呤胸腺嘧啶胞嘧啶鸟嘌呤腺嘌呤尿嘧啶胞嘧啶鸟嘌呤核酸 nucleic acidsThe structure of the DNA double helix 嘧啶嘌呤基因（gene）基因是一段DNA序列，其转录产物是编码一条多肽或蛋白质的RNA或具有独立功能的RNA，基因决定遗传性状。基因在基因组上呈直线排列并世代相传。基因组（genome）基因组
6、是指细胞或生物体的整套DNA，基因组包含整套基因的编码序列，同时还包括基因内的非编码序列及基因间序列。这些序列也同样含遗传指令。基因基因组12345671234567DNA新生mRNA成熟mRNA转录拼接-转录后修饰翻译蛋白质复制DNA Replication dATP/dGTP/dCTP/dTTP Mg2+引物（primer：DNA or RNA)DNA模板（Template）DNA多聚酶基因表达Gene expression 基因表达Gene expression 转录翻译转录 Transcription DNARNASence strandAntience strand反义链有意义链启动
7、子PromotorTATA 框CAAT框GC框增强子沉默子终止子Messenger RNA(mRNA)Ribosomal RNA(rRNA)Transfer RNA(tRNA)Long non-coding RNA small nuclear RNA(snoRNA)microRNA(miRNA)Small interfering RNA（siRNA）Piwi-interacting RNA(piRNA)RNA克雷格梅洛是美国马萨诸塞大学医学院分子医学教授。2006年因与斯坦福医学院病理学和遗传学教授安德鲁法厄发现RNA干扰现象而共同获得2006年诺贝尔生理学或医学奖。1982年获得美国布朗大学
8、学士学位，1990年在哈佛大学获得博士学位。1994年加入马萨诸塞州大学医学院任分子医学教授Craig C.Mello转录后修饰 Post-transcriptional modification mRNA转录后修饰 Post-transcriptional modification mRNA5 cap addition Splicing Polyadenylation tRNArRNAmRNA翻译 TranslationmRNAProtein(蛋白质）翻译 TranslationmRNAProtein(蛋白质）遗传密码Start：AUG一个基因一种酶（EXTL2-糖基化转移酶）一个基因一条多
9、肽链血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白两条两条链和两条链和两条链链组成四聚体的血红蛋白组成四聚体的血红蛋白:链链 链链一个基因多条多肽链（TP63基因）外显子外显子1外显子外显子2外显子外显子3外显子外显子4外显子外显子554314231534第第1个转录本个转录本第第2个转录本个转录本第第3个转录本个转录本NF1基因的有义链基因的有义链NF1基因的反义链基因的反义链外显子外显子外显子外显子5533OMGEVI2BEVI2A外显子外显子OMG、EVI2A、EVI2B三个基因在基因组上定位三个基因在基因组上定位于于NF1基因第基因第36个外显子和第个外显子和第37个外显子之间的内含子中。个外显子之
10、间的内含子中。红色：外显子红色：外显子 蓝色：内含子蓝色：内含子重叠基因基因表达的调节Regulation of gene expression DNA Interactions with proteinsAll the functions of DNA depend on interactions with proteins.These protein interactions can be non-specific,or the protein can bind specifically to a single DNA sequence.Enzymes can also bind to D
11、NA and of these,the polymerases that copy the DNA base sequence in transcription and DNA replication are particularly important.基因表达的调节乳糖操纵子模型乳糖操纵子模型基因表达的调节Regulation of gene expression 基因表达的调控基因表达的调节第二节第二节 分子生物学研究的主要方法与原理The Methods and Principles 核酸蛋白质核酸技术核酸技术核酸制备与扩增基因组DNA的提取与纯化RNA制备和cDNA的合成核酸扩增（核
12、酸扩增（PCRPCR技术技术)核酸检测核酸杂交SouthernNorthern基因芯片基因克隆基因克隆分离目的基因切割目的基因和载体目的基因和载体的连接重组DNA转化宿主细胞阳性克隆的筛选电泳分析法分光光度分析法常用的分子生物学技术PCR技术发明者1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。聚合酶链式反应聚合酶链式反应 Polymerase Chain ReactionPoly
13、merase Chain Reaction（PCRPCR）PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：1.模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。2.模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降 至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3.引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配
14、对与半保留复制原理，合 成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction（PCR）模板DNA的变性模板DNA与引物的退火(复性)引物的延伸PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物MarkerPCR产物PCR反应要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程
15、度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。PCR引物设计应遵循以下原则：1.引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。2.引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。3.引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。4.避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。5.引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基
16、，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。6.引物中有或能加上合适的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。7.引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。8.计算机软件辅助设计 1.特异性强 引物与模板DNA特异正确的结合、碱基配对原则、聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，特异性扩增靶基因区片段。2.灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的 起始待测模板扩增到微克水平。3.简便、快速 只需将引物、酶、dNTP、模板和缓冲液混合后放入PCR仪中即可。一 般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析
17、即可。4.对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品可作为扩增模板。可 直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等 DNA扩增检测。PCR优点PCR技术在临床上的应用在遗传病诊断上的应用：直接检出基因突变位点筛查与遗传病有关的点突变在现代医学检验中的应用：病原体的定性及定量检测(如病毒感染）在肿瘤基因诊断中的应用：通过检测与癌变有关的基因标志物来判定组织学的良、恶性程度，癌的进展以及肿瘤的耐药性在基因表达水平检测中的应用：定量PCR可用于检测与疾病相关蛋白基因表达水平。临床上检测肿瘤抗原的基因表达水平能对肿瘤做出早期诊断及治疗效果评价等 基因克隆：基因经无
18、性繁殖获得许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。基因克隆技术：一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工程等。步骤：1.分离目的基因 2.切割目的基因和载体 3.目的基因和载体的连接 4.重组DNA转化宿主细胞（E.Coli）5.阳性克隆的筛选 6.DNA测序分析基因克隆技术限制性内切核酸酶 (restriction endonuclease)DNA 连接酶(
19、DNA ligase)质粒(plasmid,vector)转导转染(transfection)转化(transformation)6.DNA测序RT-PCR1.目的基因2.切割目的基因和载体3.目的基因和载体的连接4.转化(E.Coli)5.阳性克隆基因克隆技术 6.DNA6.DNA测序测序 Transfection(Green Fluorescent Protein)克隆/体外表达目地基因核酸杂交技术Southern blot：检测DNANorthern blot：检测RNASouthern blot：检测DNANorthern blot：检测RNARNAReal-time PCR蛋白质技术
20、蛋白质的提取分离与纯化及定量（Protein isolation）蛋白印记法（Western blot）酶联免疫吸附试验（ELISA)免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）免疫共沉淀反应（co-immunoprecipitation)细胞免疫荧光染色方法 Immunol Fluorescence Assay（IFA）蛋白印记法（Western blot）一种分析和鉴定特定蛋白质的技术。即将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的蛋白条带。The western blot(sometimes called t
21、he protein immunoblot)is a widely accepted analytical technique used to detect specific proteins in the given sample of tissue homogenate or extract.It uses gel electrophoresis to separate native proteins by 3-D structure or denatured proteins by the length of the polypeptide.The proteins are then t
22、ransferred to a membrane(typically nitrocellulose or PVDF),where they are stained with antibodies specific to the target protein.Western blot protocol一种分析和鉴定特定蛋白质的技术。即将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的蛋白条带。蛋白样品蛋白样品制备和上样制备和上样电泳电泳转膜转膜封闭封闭一抗一抗二抗二抗底物（底物（ECLECL）免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistoc
23、hemistry，IHC）应用免疫学（抗原抗体特异性结合）及组织化学原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术Immunohistochemistry or IHC refers to the process of detecting antigens(e.g.,proteins)in cells of a tissue section by exploiting the principle of antibodies binding specifically to antigens in biological tissues.IHC take
24、s its name from the roots immuno,in reference to antibodies used in the procedure,and histo,meaning tissue(compare to immunocytochemistry).1 免疫荧光方法先将已知抗体标上荧光素，当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，在荧光显微镜下可观察到某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。2 免疫酶标方法基本原理是先以酶标记的抗体与组织作用，然后加入酶的底物，
25、生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，在显微镜下对各种抗原成分进行定位研究。本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存。免疫组织化学免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）免疫酶标方法免疫荧光方法免疫共沉淀反应免疫共沉淀反应（co-immnoprecipitation)免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用
26、被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。Immunoprecipitation(IP)is the technique of precipitating a protein antigen out of solution using an antibody that specifically binds to that particular protein.This process can be used to isolate and concentrate
27、 a particular protein from a sample containing many thousands of different proteins.Immunoprecipitation requires that the antibody be coupled to a solid substrate at some point in the procedure.免疫共沉淀反应（co-immnopricipitation)Western blot细胞免疫荧光染色方法Immunol Fluorescence Assay（IFA）免疫染色的实验原理类似于Western Blo
28、tting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在细胞内原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。Immunofluorescence is a technique used for light microscopy with a fluorescence microscope and is used primarily on biological samples.This technique uses the specificity of antibodies to their antigen to target fluorescent dyes t
29、o specific biomolecule targets within a cell,and therefore allows visualisation of the distribution of the target molecule through the sample.Immunofluorescence is a widely used example of immunostaining and is a specific example of immunohistochemistry that makes use of fluorophores to visualise the location of the antibodies.激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜下观察细胞 基因表达谱分析Confirm by qPCRSelect some High or Low DNA-蛋白之间的相互关系DNA affinity purificationHIV VirusH1N1 VirusEB VirusSARS Virus细菌 bacteria
