1、p53与肝癌的基因治疗 .v肝癌v机制v抑癌基因vp53vp53基因与肝癌的基因治疗v存在的问题v展望.肝癌概念：指概念：指肝细胞肝细胞 或或 肝内肝内胆管细胞胆管细胞 较常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食管癌较常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食管癌 本病以本病以4049岁为多，男女发病率之比为岁为多，男女发病率之比为25 1 每年新增病例：每年新增病例：5050多万多万 主要临床表现：肝区疼痛、肝脏肿大、黄疸、肝硬化症状等主要临床表现：肝区疼痛、肝脏肿大、黄疸、肝硬化症状等 治疗：手术、介入、放疗、化疗、治疗：手术、介入、放疗、化疗、生物和免疫治疗生物和免疫治疗等等 5 5年病死率：超过
2、年病死率：超过95%95%发生的癌肿发生的癌肿.机制 肿瘤发生发展过程中，由于各种基因表达及其调控的变化，使细胞在信号转导网络上表现出与正常细胞的显著差异。正常细胞的一些信号转导通路在肿瘤细胞中表现为过度活跃，而另一些信号转导通路则被阻断。这种细胞内信号转导的异常干扰了细胞对增殖、分化、凋亡等多方面的自身调控，特别是造成细胞增殖和凋亡失控，成为肿瘤发病的重要分子基础。随着分子生物学和免疫学技术的飞速发展，基因治疗技术在肿瘤的治疗中具有广阔的前景。基因治疗的方式有两类，一类为基因矫正与置换，即将缺陷基因的异常序列进行校正，对缺陷基因进行精确的原位修复；另一类为基因增补，不去除异常基因，而是通过外
3、源基因的非定点整合，使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因的功能，达到治疗目的的一种方法。.抑癌基因 抑癌基因的突变、缺失及失活在肝癌的发生发展中起着关键性的作用。目前，新发现的抑癌基因层出不穷，较常见的有p53、p16、Rb、BCL-XS等。随着人们对肝癌发病机制的深人了解，越来越多的证据表明：p53基因的突变与失活和肝癌的发生发展有着密切联系。近年来，随着手术、放疗及生物治疗等方法的研究进展，使肿瘤综合治疗水平有了明显提高，尤其是肿瘤体外细胞和动物模型基因治疗，逐渐从单纯的基础研究过渡到临床研究和应用。本文主要从p53在肝癌基因治疗方面作一简要介绍。.p53 v生物体所有组织都存在p53蛋白，
4、在整个进化中变现高度保守。虽然p53对生命不是必需的，但是在细胞水平维持遗传稳定性起关键作用。这是极端重要的，因为遗传损伤逐渐导致肿瘤发生和产生癌。六分之一人群由于p53功能缺陷发展成癌这一统计判断，强调指出p53作为一种肿瘤抑制蛋白的重要性。v在对DNA损伤应答时激活p53蛋白，以转录因子而起作用，能结合DNA特异序列（p53应答元件），而且上调靶基因的表达。在这些条件下，p53诱导细胞生长停止或者程序性细胞死亡（凋亡）。这两种应答预防细胞群内遗传损伤的复制和扩增。.DNA damagep53Cell growth arrestApoptosisp53 activation and accu
5、mulation.细胞内p53蛋白的浓度增加是其对DNA损伤的应答。这种作用不依赖于基因转录而涉及转录后的调控机制，与预先存在p53mRNA增加的翻译有关。在整个基因表达调控中，转录后的机制是重要的，而且特别是可能比转录调控有更快的应答。该过程涉及胞浆内mRNA-蛋白质的相互作用，但是p53浓度增加的精确机制是不清楚的。.p53基因与肝癌的基因治疗 p53基因应用于肝癌的基因治疗,是以正常的野生型p53基因替代肝癌细胞中突变的p53基因。利用基因转染肝癌细胞，寻找高效、导向性的载体系统成为肝癌基因治疗临床应用的关键。目前,向肝癌细胞内导人外源基因的方法主要有病毒法和非病毒法两种。.l病毒法v常
6、用的病毒以逆转录病毒和腺病毒作载体，其中逆转录病毒载体只感染处于分裂期的细胞，如肿瘤细胞，而对高分化不分裂的细胞就不能实施基因转移。腺病毒载体则对各期的细胞均可感染，所以目前腺病毒载体更常用作p53转移的载体，腺病毒介导的p53基因治疗已广泛开展。.Rei-set M等通过实验证实：腺病毒介导的基因转移可有效地将p53基因导人肿瘤细胞中；以GFP为报告基因，观察到了腺病毒对肝癌细胞BEL402、HLE及HuH 7均有很高的转染率，腺病毒能有效地将目的基因导入肝癌细胞 中并高效表达。BIY2102腺病毒载体转染后能显著提高 p53突变的HIE和HUH27细胞对顺铂和丝列霉素2C的敏感性，增强了化
7、疗药物对HIE和HUH27细胞的杀伤作用，这为以腺病毒为载体将目的基因导人肝癌细胞提供了前提。有资料显示：用野生型p53腺病毒载体经肝动脉注射治疗转移性肝癌的临床试验 ，野生型p53基因导人肝癌细胞中，可以发挥杀灭或抑制肝癌细胞生长的作用，Terence 等以受体介导基因转移系统介导野生型 p53转染含突变 p53的肝癌细胞株，发现能明显抑制瘤细胞的生长，通过表达wtp53重组腺病毒载体，将p53基因导人肝癌细胞株一 PLE/PRE/5细胞，通过诱导其凋亡和细胞周期阻滞可抑制癌细胞的生长。.举例方法：构建含人p53、B7-1、GM-CSF和IL-2 4种目的基因的重组腺病毒载体，感染3种肝细胞
8、癌细胞系和肝细胞系L02，运用ELISA、免疫组化、流式细胞仪等方法，检测目的基因在肝癌细胞中的表达，和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果：肝癌细胞对腺病毒高度易感，腺病毒多重感剂量为50(50 MOI)时，可使90%左右的肝细胞癌表达目的基因。除IL-2外，其他3个目的基因都能在肝癌细胞中高效表达。导入多基因后，肝癌细胞的生长受到一定程度的抑制，并诱导肝癌细胞发生凋亡；而L02肝细胞的生长却未受影响。结论：腺病毒载体是进行肝癌基因治疗的理想载体，由一个腺病毒载体介导的多种目的基因，能在肝癌细胞系中高效表达，且能抑制肝癌细胞的生长和诱导其调亡。-腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响
9、中国普外基础与临床杂志 2000年第6期第7卷.l非病毒法 脂质体载体 脂质体(liposome)是磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡结构，每层均为类脂双分子膜，层间和脂质体内核为水相，双分子膜为油相。通过脂质体介导进行基因转移具有以下优势：脂质体是非病毒性载体，转染过程方便易行，重现性好，与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质即被降解，无毒，无免疫原性；DNA或RNA可得到保护，不被灭活或被核酸酶降解；脂质体携带的基因可能转运至特定部位；体外和体内试验都表明，接近染色体大小的DNA片段也能被转运至宿主基因组中并增长。运用脂质体作为载体较单纯导人基因具有更高的转
10、染效率，在一定范围内，基因的量与转染效率成正比，同时宿主体不会出现外源性病毒基因所致的 特异性免疫反应，表达时间较腺病毒载体长、分裂期及非分裂期细胞均可被转染等特点。研究表明转铁蛋白能增强脂质体一基因转染 。.举例方法：将载有人野生型p53-cDNA的真核表达质粒p53-pcDNA3，用阳离子脂质体介导转染人肝癌细胞系HepG2，用流式细胞仪检测p53-pcDNA3对HepG2细胞生长的影响。结果：通过观察细胞生长曲线与流式细胞仪检测细胞周期和细胞的凋亡指数发现，HepG2细胞生长受到明显的抑制。结论：脂质体介导的p53基因可在HepG2细胞中表达，且明显抑制该细胞的生长。-脂质体介导的p53
11、基因对肝癌细胞生长的抑制作用 免疫学杂志 2000年第5期第16卷.lPTD 融合蛋白系统 PTD 融合蛋白系统(protein transduetion domain，PTD)是一个富含碱性氨基酸残基的蛋白结构域，PTD融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具。丁忠阳等成功构建了含 p53基因的原核表达载体 pTATHAp53，在大肠杆菌BI21(DE3)Lyss内诱导表达并进行了纯化。通过纯化的 p53蛋白经腹腔免疫 BALBc小鼠，制备高效价的抗血清，为应用PTD p 5 3基因治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。.举例 方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,
12、将该基因分别克隆入pTATHA和pET 32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将PTD-p53融合蛋白加入HepG2 细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测PTD-p53融合蛋白导入HepG2 细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了p53 融合蛋白及p53蛋白,证实PTD-p53可以高效地转入HepG2细胞。结论：PTD-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用PTD-p53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。-PTD-p53 融合蛋白的表达、纯化及
13、其对肝癌细胞的转导活性 期刊荣誉：ASPT来源刊 CJFD收录刊.存在的问题 p53基因在治疗人类恶性肿瘤基因治疗中取得了一定的成绩，但仍存在许多不足之处。缺乏高效的载体系统，目前被应用的载体都存在自身局限性，而且病毒本身也可导致相应的不良反应。p53基因目的基因的持续表达。降低p53基因在宿主体内的毒性和免疫原性是否会诱发原 癌基因以及病人的安全性(如最小治疗剂量、最 大毒性、耐受性及诱变性)等问题都有待进一步解决。.展望 p53基因是一种理想的分子靶向肝癌治疗基因之一。通过人工转导修补突变的p53基因，可恢复其抑癌功能，通过拯救突变型p53基因、转染野生型p53基因的方法治疗肝癌不失为一种理想的治疗方法，但还需要更进一步的研究寻找更高转染率的载体、更好的导人途径和方法，确保 安全性和有效性。尽管还存在很多需要解决的问题，随着医学和科学技术的发展，科学研究的不断深人，肿瘤基因治疗将成为今后肿瘤治疗的发展趋势之一。此外，p53基因治疗肿瘤只是开了一个好头，为人类征服癌症带来了新的希望和曙光。.谢谢！谢谢！.
