1、Medical Department of Medical Department of Southern Yangtze UniversitySouthern Yangtze University本章重点本章重点掌握凝集反应、沉淀反应的概念、抗掌握凝集反应、沉淀反应的概念、抗原抗体反应的特点与影响因素。原抗体反应的特点与影响因素。熟悉临床上常用的直接凝集反应、双熟悉临床上常用的直接凝集反应、双向琼脂扩散、对流免疫电泳、免疫酶向琼脂扩散、对流免疫电泳、免疫酶技术和免疫胶体金技术。技术和免疫胶体金技术。了解免疫细胞的功能测定和细胞因子了解免疫细胞的功能测定和细胞因子的检测。的检测。免疫学检测技术的
2、应用免疫学检测技术的应用1.1.疾病的诊断疾病的诊断感染性疾病、自身免疫病、肿瘤、感染性疾病、自身免疫病、肿瘤、免疫缺陷病、超敏反应性疾病等。免疫缺陷病、超敏反应性疾病等。2.2.疾病治疗效果评价疾病治疗效果评价疾病预后、转归等监测疾病预后、转归等监测3.3.免疫功能检测免疫功能检测细胞免疫功能，体液免疫功能，非细胞免疫功能，体液免疫功能，非特异性免疫功能测定等。特异性免疫功能测定等。第一节第一节 抗原或抗体的体外检测抗原或抗体的体外检测根据抗原与抗体特异性结合反应的特性，根据抗原与抗体特异性结合反应的特性，用肉眼观察或借助仪器检测抗原抗体反用肉眼观察或借助仪器检测抗原抗体反应的结果，由此对样
3、品中的抗原或抗体应的结果，由此对样品中的抗原或抗体进行定性、定量或定位分析。进行定性、定量或定位分析。+一、抗原抗体反应的特点一、抗原抗体反应的特点1.1.高度特异性高度特异性抗体可变区与相应抗原表位的空间抗体可变区与相应抗原表位的空间构型互补，高度特异性地结合。构型互补，高度特异性地结合。2.2.反应可逆性反应可逆性抗原抗体以非共价键结合，易受温抗原抗体以非共价键结合，易受温度、度、pHpH和离子强度的影响而解离。和离子强度的影响而解离。抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点3.3.抗原抗体的比例合适抗原抗体的比例合适抗原略多于抗体的比例，可形成抗原略多于抗体的比例，可形成肉眼可见的复合物。肉
4、眼可见的复合物。4.4.反应分两个阶段反应分两个阶段非共价结合阶段非共价结合阶段反应迅速反应迅速ICIC形成大复合物形成大复合物反应较慢反应较慢二、影响抗原抗体反应的因素二、影响抗原抗体反应的因素1.1.抗原抗体的浓度比例抗原抗体的浓度比例比例适当才能形成可见的反应复合物比例适当才能形成可见的反应复合物2.2.电解质电解质常用常用0.85%0.85%NaCLNaCL溶液溶液3.3.温度温度最适温度最适温度3737度度4.4.酸碱度酸碱度最适最适PH 6PH 68 8三、抗原抗体反应类型三、抗原抗体反应类型（一）凝集反应（一）凝集反应概念：概念：颗粒性抗原颗粒性抗原(细菌、红细胞等细菌、红细胞等
5、)与相应抗体结合，在一定条件下出现与相应抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。1.1.直接凝集反应直接凝集反应抗原与抗体直接混合作用，出现凝集抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳性结果。为阳性结果。玻片直接凝集法：定性试验玻片直接凝集法：定性试验试管直接凝集法：半定量试验试管直接凝集法：半定量试验试管法半定量试验试管法半定量试验+玻片直接凝集试验玻片直接凝集试验1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5122.2.间接凝集法间接凝集法 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上(如如RB
6、C,RBC,乳胶颗粒乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗，再与相应抗体或抗原反应，出现凝集为阳性结果。原反应，出现凝集为阳性结果。临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试验等。验等。+待检样品待检样品抗原吸附血球抗原吸附血球或乳胶颗粒或乳胶颗粒反应凝集物反应凝集物3.3.间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。例：乳胶凝集抑制试验检测例：乳胶凝集抑制试验检测HCG(HCG(妊娠诊断妊娠诊断)步骤步骤1 1：将已
7、知抗：将已知抗HCGHCG抗体与待检标本混匀抗体与待检标本混匀 步骤步骤2 2：加入：加入HCGHCG吸吸附的乳胶颗粒混匀附的乳胶颗粒混匀HCGHCG吸附乳吸附乳胶颗粒胶颗粒结果判断：结果判断：不 凝 集 为不 凝 集 为阳性结果阳性结果已知抗体已知抗体待检标本待检标本凝集反应凝集反应（二）沉淀反应（二）沉淀反应概念：概念：可溶性抗原与相应抗体结合，在可溶性抗原与相应抗体结合，在一定条件下形成免疫复合物沉淀，称为一定条件下形成免疫复合物沉淀，称为沉淀反应。沉淀反应。1.1.速率散射比浊法速率散射比浊法根据溶液中颗粒性物质对可见光的吸收根据溶液中颗粒性物质对可见光的吸收强弱强弱(朗伯朗伯-比尔定
8、律比尔定律)来测定来测定ICIC的浓度，的浓度，可通过仪器进行自动化检测。可通过仪器进行自动化检测。2.2.琼脂扩散法琼脂扩散法在在琼脂凝胶中进行的沉淀反应，称为琼琼脂凝胶中进行的沉淀反应，称为琼脂扩散试验。脂扩散试验。(1)(1)单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验 方法：将一定量的已知抗体加入融化的琼脂中方法：将一定量的已知抗体加入融化的琼脂中制成凝胶板，打孔，在孔内加抗原，放湿盒内制成凝胶板，打孔，在孔内加抗原，放湿盒内于于3737扩散扩散2424h h。结果：孔周围出现沉淀环。定量检测，环直径结果：孔周围出现沉淀环。定量检测，环直径与抗原含量呈正比。与抗原含量呈正比。常用于常用于IgIg、
9、C C等含量测定。等含量测定。单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验AgAgAgAg含抗体凝胶含抗体凝胶抗原浓度抗原浓度沉淀环直径沉淀环直径沉淀环沉淀环(2)(2)双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验方法：琼脂板中打孔，抗原与抗方法：琼脂板中打孔，抗原与抗体分别加入孔中，放湿盒内于体分别加入孔中，放湿盒内于3737扩散扩散2424h h。结果：两孔间之间出现沉淀线为结果：两孔间之间出现沉淀线为阳性阳性常用于定性检测抗原或抗体中的常用于定性检测抗原或抗体中的相关成分相关成分双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验(3)(3)对流免疫电泳对流免疫电泳 方法：将双向琼脂扩散反应放在电场中进行，使方法：将双向琼脂扩散反
10、应放在电场中进行，使抗原抗体在电场力的作用下相对泳动，使反应速抗原抗体在电场力的作用下相对泳动，使反应速度加快，检测时间缩短。度加快，检测时间缩短。结果：同双向琼脂扩散结果：同双向琼脂扩散AgAb-+对流免疫电泳对流免疫电泳（三）免疫标记技术（三）免疫标记技术 免疫标记技术是利用荧光素、酶、放射性同位免疫标记技术是利用荧光素、酶、放射性同位素等物质标记抗原或抗体，通过检测标记物质素等物质标记抗原或抗体，通过检测标记物质的发光、颜色反应或射线强度，间接测定待检的发光、颜色反应或射线强度，间接测定待检标本中的抗体或抗原的免疫学方法。标本中的抗体或抗原的免疫学方法。免疫标记技术是目前应用最广泛的免疫
11、学检测免疫标记技术是目前应用最广泛的免疫学检测技术，常用的方法有：技术，常用的方法有：免疫酶测定技术免疫酶测定技术免疫荧光技术免疫荧光技术放射免疫测定技术放射免疫测定技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术1 1、酶免疫测定技术、酶免疫测定技术 概念：概念：用酶标记已知抗原或抗体，检测标本中用酶标记已知抗原或抗体，检测标本中的相应抗体或抗原，将抗原抗体反应的高度特的相应抗体或抗原，将抗原抗体反应的高度特异性与酶催化底物的显色反应相结合的免疫学异性与酶催化底物的显色反应相结合的免疫学检测技术。检测技术。常用的标记酶常用的标记酶辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。常用的方法常用的方法酶
12、联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA)双抗体夹心法双抗体夹心法测定抗原测定抗原间接法间接法测定抗体测定抗体酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA)将已知抗原或抗体吸附在固相载体将已知抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯板聚苯乙烯板)上进行酶免疫反应，检测相应的抗体或抗原。上进行酶免疫反应，检测相应的抗体或抗原。(1)(1)双抗体夹心法双抗体夹心法(测抗原测抗原)先将已知抗体吸附在固相载先将已知抗体吸附在固相载体上，加入待检抗原，再加体上，加入待检抗原，再加入酶标记的已知抗体，反应入酶标记的已知抗体，反应后形成后形成“抗体抗体-抗原抗原-酶标抗酶标抗体体”复合
13、物，最后加入酶的复合物，最后加入酶的底物显色。底物显色。固相固相载体载体Ag 已知抗体已知抗体病人血清病人血清酶标记酶标记的抗体的抗体酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA)(2)(2)间接法间接法(测抗体测抗体)先将已知抗原吸附在先将已知抗原吸附在固相载体上，加入待固相载体上，加入待检血清，再加入酶标检血清，再加入酶标记的抗抗体，反应后记的抗抗体，反应后形成形成“抗原抗原-抗体抗体-酶酶标抗抗体标抗抗体”复合物，复合物，最后加入酶的底物显最后加入酶的底物显色。色。固相固相载体载体Ag 已知抗原已知抗原病人血清病人血清酶标记酶标记抗抗体抗抗体酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验
14、(间接法间接法)2 2、免疫荧光技术、免疫荧光技术用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中用荧光素标记抗原或抗体，再与标本中抗体或抗原反应，然后在荧光显微镜下抗体或抗原反应，然后在荧光显微镜下观察，形成的观察，形成的ICIC可散发出荧光，对标本可散发出荧光，对标本中的抗原或抗体进行测定和定位。中的抗原或抗体进行测定和定位。常用的荧光素常用的荧光素异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素(FITC)FITC)、藻红蛋白藻红蛋白(PE)PE)等。等。常用的方法常用的方法直接荧光法直接荧光法间接荧光法间接荧光法免疫荧光技术免疫荧光技术直接法直接法Ag荧光素标记的荧光素标记的特异性抗体特异性抗体组织切片组织切片免疫荧光
15、技术免疫荧光技术间接法间接法Ag荧光素标记荧光素标记的抗抗体的抗抗体组织切片组织切片待测抗体待测抗体免疫荧光技术免疫荧光技术3 3、放射免疫测定技术、放射免疫测定技术 先将放射性同位素标记已知抗原或抗体，与待检标先将放射性同位素标记已知抗原或抗体，与待检标本反应后，用仪器测定反应物的放射性强度，根据本反应后，用仪器测定反应物的放射性强度，根据放射性强度计算标本中抗原或抗体的含量。放射性强度计算标本中抗原或抗体的含量。放射免疫测定法的敏感性高，常用于微量物质如胰放射免疫测定法的敏感性高，常用于微量物质如胰岛素，甲状腺素，岛素，甲状腺素，IgEIgE，地高辛等测定。地高辛等测定。常用于标记的同位素
16、常用于标记的同位素131131I I、125125I I、1414C C、3232P P等等 常用的测定方法常用的测定方法液相放射免疫测定法液相放射免疫测定法固相放射免疫测定法固相放射免疫测定法4 4、金免疫技术、金免疫技术用胶体金颗粒标记已知抗体或抗原，检用胶体金颗粒标记已知抗体或抗原，检测标本中未知抗原或抗体的技术。测标本中未知抗原或抗体的技术。原理：以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗原理：以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用使体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再
17、通过胶体金标记物的显色（结合，再通过胶体金标记物的显色（2020nmnm的的胶体金颗粒呈砖红色）达到检测目的。胶体金颗粒呈砖红色）达到检测目的。根据检测装置的不同，可分为胶体金斑点渗滤根据检测装置的不同，可分为胶体金斑点渗滤试验和胶体金斑点免疫层析试验试验和胶体金斑点免疫层析试验。胶体金斑点免疫层析试验胶体金斑点免疫层析试验将各种反应试剂将各种反应试剂(抗体抗体)附着在硝酸纤维素附着在硝酸纤维素膜条上，检测时将待检标本加在膜条的一膜条上，检测时将待检标本加在膜条的一端，使膜条上的胶体金标记抗体溶解后，端，使膜条上的胶体金标记抗体溶解后，与标本中的待测物质反应形成与标本中的待测物质反应形成ICI
18、C，并通过并通过毛细管作用在膜条上渗滤、移行，再与膜毛细管作用在膜条上渗滤、移行，再与膜上另一种抗体反应，再后被截留、聚集在上另一种抗体反应，再后被截留、聚集在膜条的一定区域，形成有颜色的反应条带。膜条的一定区域，形成有颜色的反应条带。临床上常用的有胶体金早孕诊断试剂临床上常用的有胶体金早孕诊断试剂第二节第二节 免疫细胞的检测免疫细胞的检测一、免疫细胞的分离一、免疫细胞的分离1 1、外周血单个核细胞的分离、外周血单个核细胞的分离2 2、树突状细胞前体的分离、树突状细胞前体的分离3 3、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离二、免疫细胞功能测定二、免疫细胞功能测定1.T1.T细胞功能测定细
19、胞功能测定 淋巴细胞转化试验：用淋巴细胞转化试验：用PHA(PHA(植物血凝素植物血凝素)刺刺激体外培养的激体外培养的T T细胞，使细胞，使T T细胞发生活化反细胞发生活化反应，向增殖细胞转化。应，向增殖细胞转化。E E花环形成试验：测定花环形成试验：测定T T细胞总数细胞总数 细胞毒试验：常用同位素细胞毒试验：常用同位素5151Cr(Cr(铬铬)释放法释放法 2.B2.B细胞功能测定：各类细胞功能测定：各类IgIg的含量测定、溶血的含量测定、溶血空斑试验、酶联免疫斑点法。空斑试验、酶联免疫斑点法。免疫细胞分离及数量检测免疫细胞分离及数量检测 外周血外周血 单个核细胞单个核细胞 鼠抗人鼠抗人CD3CD3单抗单抗 CD4CD4T T细胞数细胞数鼠抗人鼠抗人CD4CD4单抗单抗 CD8CD8T T细胞数细胞数总总T T细胞数细胞数 鼠抗人鼠抗人CD8CD8单抗单抗兔抗鼠荧光抗体兔抗鼠荧光抗体 兔抗鼠荧光抗体兔抗鼠荧光抗体 兔抗鼠荧光抗体兔抗鼠荧光抗体 606080%80%555560%60%202030%30%正常值：正常值：CD4CD4T/CD8T/CD8T T 比值比值=2:1 2:1 T T细胞总数及亚群检测细胞总数及亚群检测第三节第三节 细胞因子检测细胞因子检测生物活性方法生物活性方法免疫学方法免疫学方法分子生物学方法分子生物学方法
