1、遗传学课件12第十二章（遗传工程）广义生物工程：细胞工程、基因工程、酶工广义生物工程：细胞工程、基因工程、酶工程、发酵工程程、发酵工程第一节第一节 基因工程概述基因工程概述生物工程（生物工程（biological engineeringbiological engineering）是指利用工程技术的方法改造和修饰生是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。改良生物体的一种遗传学手段。狭义生物工程：基因工程狭义生物工程：基因工程基因工程基因工程定义定义：利用人工的方法把生物的遗传物质：利用人工的方法把生物的遗
2、传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重在体外进行切割、拼接和重组，获得重组组DNADNA分子，然后导入宿主细胞或个体，分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。程。基因工程的特点基因工程的特点1 1、跨越天然物种屏障，实现动物、植物、跨越天然物种屏障，实现动物、植物、微生物间的遗传物质交换。微生物间的遗传物质交换。2 2、只定向改变一个或少数几个性状，而不、只定向改变一个或少数几个性状，而不改变品种的其他特性。改变品种的其他特性。3 3、可以人为控制基因的表达。、可以人为控制基因的表达。植物表达载体的构建植物表达载体的构建转化植物细
3、胞转化植物细胞 筛选抗生素抗性细胞筛选抗生素抗性细胞 再生抗性植株再生抗性植株整合整合PCR,Southern杂交杂交,原位杂交原位杂交转录转录RT-PCR,定量定量PCR,Northern杂交杂交翻译翻译Western杂交杂交 生物检测生物检测遗传分析遗传分析基本技术流程：基本技术流程：目的基因克隆目的基因克隆第二节第二节 基因的分离基因的分离基因克隆通常包括三个步骤：1）目标DNA片段（基因）的分离；2）目标基因克隆到载体上；3）载体导入宿主细胞并在其中大量复制。一、工具酶一、工具酶（一）限制性核酸内切酶（限制性酶）（一）限制性核酸内切酶（限制性酶）（restriction enzymer
4、estriction enzyme）在识别双链在识别双链DNADNA分子中某些特定核苷酸序列分子中某些特定核苷酸序列的基础，切割的基础，切割DNADNA双链的内切酶。双链的内切酶。细菌（宿主）本身的DNA通过甲基化酶的作用，使DNA得到修饰修饰，免遭自身限制性内切酶的破坏。胞嘧啶胞嘧啶5甲基胞嘧啶甲基胞嘧啶甲基化甲基化 细菌细胞具有防御异源遗传物质（病毒）的进入的能力，异源DNA分子进入后，会被限制酶识别并降解，这个过程称为限制限制。限制修饰系统：限制修饰系统：型限制性内切酶：型限制性内切酶：酶切部位有特异性，能识别酶切部位有特异性，能识别DNADNA分子上特分子上特定的定的DNADNA序列。
5、序列。型限制性内切酶：型限制性内切酶：酶切部位没有特异性，随机切割双链酶切部位没有特异性，随机切割双链DNADNA分分子。子。EcoB和和EcoK型限制性内切核酸酶（型限制性内切核酸酶（型酶）型酶）具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。三种限制性内切酶三种限制性内切酶型酶有几个基本特性型酶有几个基本特性 在在DNADNA分子上有特异分子上有特异识别和切割的序列部位识别和切割的序列部位，使被切割的使被切割的DNADNA分子形成分子形成单链的断裂单链的断裂；DNA DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的
6、；相对的；断裂结果所形成的断裂结果所形成的DNADNA片段常具有碱基互补的片段常具有碱基互补的单链尾巴（单链尾巴（粘性末端粘性末端），使其能够重新连接；），使其能够重新连接；内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成，即该类内切酶活性和甲基化作用活化所完成，即该类内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，只需要性是分开的，只需要MgMg2+2+来激活，不需要来激活，不需要ATPATP辅辅助因子。助因子。表表12-1 不同限不同限制酶的识别、制酶的识别、切割和修饰位切割和修饰位点点 echo-r-one回纹对称序列回纹对称序列（二）（二）DNA连接酶连接酶 能
7、催化能催化DNADNA中相邻的中相邻的3 OH3 OH和和5 5 磷磷酸基酸基末端之间形成末端之间形成磷酸二酯磷酸二酯键键并把两段并把两段DNADNA连接起连接起来。来。在分子克隆中使用的在分子克隆中使用的DNADNA连接酶有两种。连接酶有两种。即即大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶和连接酶和T4 DNAT4 DNA连接酶。连接酶。两种两种DNADNA连接酶都不能催化单链连接酶都不能催化单链DNADNA之间的连之间的连接反应，被连接的接反应，被连接的DNADNA链必须是链必须是双链双链DNADNA分子分子的一部分。的一部分。T4 DNAT4 DNA连接酶还可以催化二个具有连接酶还可以催化二个具
8、有平齐末端平齐末端的双链的双链DNADNA片段之间的连接反应，而大肠杆菌片段之间的连接反应，而大肠杆菌连接酶一般不具有这种活性。连接酶一般不具有这种活性。（三）反转录酶（三）反转录酶 反转录酶（反转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）是）是一类以一类以RNARNA为模板来指导为模板来指导DNADNA合成的合成的DNADNA聚聚合酶，所以又称为依赖于合酶，所以又称为依赖于RNARNA的的DNADNA聚合聚合酶。酶。反转录酶在遗传工程中的主要用途是反转录酶在遗传工程中的主要用途是以以mRNAmRNA为模板合成为模板合成cDNA cDNA。cD
9、NA文库代表的文库代表的是某一特定细胞，是某一特定细胞，或组织，或某一发或组织，或某一发育阶段的表达的基育阶段的表达的基因，而基因组文库因，而基因组文库代表的是基因组中代表的是基因组中所有的基因。所有的基因。（四）聚合酶链式反应（四）聚合酶链式反应 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain polymerase chain reactionreaction，PCRPCR）PCRPCR反应在一种混合液中进行（反应在一种混合液中进行（PCR PCR mixturemixture）包括四种主要成分：两个引物）包括四种主要成分：两个引物（一般为（一般为20 bp20 bp）；模
10、板）；模板DNADNA；热稳定的；热稳定的DNADNA聚合酶和四种脱氧核苷酸。聚合酶和四种脱氧核苷酸。聚合酶是聚合酶是TaqTaq酶（酶（AmpliTaq polymeraseAmpliTaq polymerase，在在9595甚至更高的温度下活性稳定）。甚至更高的温度下活性稳定）。PCRPCR反应已经自动化，在反应已经自动化，在PCRPCR仪（仪（thermocyclerthermocycler）上进行。上进行。基本过程：基本过程：通过高温，双链通过高温，双链DNADNA变成单链变成单链DNADNA变性；变性；通过降低温度，使引物和摸板配对通过降低温度，使引物和摸板配对退火退火;利用耐热利用
11、耐热DNADNA聚合酶聚合酶,合成产物合成产物DNADNA延伸。延伸。变性温度：变性温度：93-94 93-94，30-6030-60秒秒 退火温度：退火温度：36-60,30-6036-60,30-60秒秒 延伸温度：延伸温度：72,1.5-272,1.5-2分分循环循环30-4030-40次次;最后最后72 72 补齐补齐1010分钟。分钟。循环数PCR产物拷贝数12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824表表12-2 PCR循环数与循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系产物的拷贝数之间的关系 图图1
12、2-6 在紫外灯下观察到的琼脂糖凝胶电泳后的在紫外灯下观察到的琼脂糖凝胶电泳后的DNA条带条带二、载体(vector)（一）重组（一）重组DNA技术技术重组重组DNADNA（recombinant DNArecombinant DNA）主要指利用不同生）主要指利用不同生物来源的物来源的DNADNA分子拼接的杂种分子拼接的杂种DNADNA分子，是自分子，是自然界中不存在的然界中不存在的DNADNA分子。分子。重组重组DNA的步骤的步骤（1 1）从细胞或组织获得）从细胞或组织获得DNADNA并纯化；并纯化；（2 2）用限制酶切割）用限制酶切割DNADNA；（3 3）将获得的限制片段连接到载体上。）
13、将获得的限制片段连接到载体上。（4 4）重组）重组DNADNA导入宿主细胞，在宿主细胞内导入宿主细胞，在宿主细胞内重组重组DNADNA分子复制，产生大量相同拷贝的分子复制，产生大量相同拷贝的重组重组DNADNA分子，称为克隆；分子，称为克隆；（5 5）克隆的）克隆的DNADNA分子可以从宿主细胞中回收，分子可以从宿主细胞中回收，纯化；纯化；（6 6）克隆的）克隆的DNADNA可以转录和翻译，其产品可可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业开发。以被分离出来用于研究或商业开发。图图12-5 重组重组DNA技术流程技术流程（二）载体(vector)作为载体作为载体DNA分子，必须储备的分
14、子，必须储备的4个条件：个条件：（1 1）具有复制原点，在宿主细胞中不仅能独立地自我）具有复制原点，在宿主细胞中不仅能独立地自我复制，而且能带动携带的外源基因一起复制。复制，而且能带动携带的外源基因一起复制。（2 2）具有多克隆位点，即具有多种限制性酶切位点，）具有多克隆位点，即具有多种限制性酶切位点，且每一种酶的切点只有一个。且每一种酶的切点只有一个。（3 3）至少具有一个选择标记基因。如抗菌素的抗性基）至少具有一个选择标记基因。如抗菌素的抗性基因或某种酶的基因。因或某种酶的基因。（4 4）分子量小，多拷贝，易于操作。分子量小，多拷贝，易于操作。1、质粒载体质粒：质粒：细菌细胞内细菌细胞内独
15、立于细菌染色独立于细菌染色体而自然存在的、体而自然存在的、能自我复制、易能自我复制、易分离和导入的环分离和导入的环状双链状双链DNA分子。分子。外源外源DNA片段小于片段小于10kb图图12-8 质粒质粒PUC18的结构及多的结构及多克隆位点克隆位点 互补：互补是指大肠杆菌互补是指大肠杆菌-半乳糖苷酶的两半乳糖苷酶的两个无活性片段组合成为功能完整的酶的过个无活性片段组合成为功能完整的酶的过程。程。受体片段：酶的受体片段：酶的C端片段，一般存在于宿端片段，一般存在于宿主细胞。主细胞。供体片段：酶的供体片段：酶的N端片段，一般存在于端片段，一般存在于质粒载体。质粒载体。供体片段供体片段+受体片段受
16、体片段 有活性有活性 质粒载体含有质粒载体含有 LacZLacZ基因的基因的N N端编码序列，端编码序列，在编码区含有多克隆位点，不影响酶的在编码区含有多克隆位点，不影响酶的活性，选择含有活性，选择含有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C端片段端片段的宿主细胞。的宿主细胞。在含有在含有X-galX-gal（5-5-溴溴-4-4-氢氢-3-3-吲哚吲哚-D-D-半乳糖苷）的培养基中形成兰色菌半乳糖苷）的培养基中形成兰色菌落，但如果外源落，但如果外源DNADNA插入到多克隆位点，插入到多克隆位点，将绝对地产生不具有将绝对地产生不具有互补功能的互补功能的N N端片端片段产生，菌斑为白色。段产生，菌斑为白色。
17、图图12-6重组质粒的蓝白斑筛选重组质粒的蓝白斑筛选 2、病毒载体、病毒载体噬菌体载体噬菌体载体可以接受可以接受1523kb的外的外源源DNA片段片段图图12-10利用噬菌体为载体克隆外利用噬菌体为载体克隆外源源DNA的策略的策略 3、克隆大片段、克隆大片段DNA的载体的载体 黏粒载体、细菌人工染色体和酵黏粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体母人工染色体载体。图图12-11黏粒载体黏粒载体pJB8图谱图谱 黏粒载体（黏粒载体（cosmid）柯斯）柯斯质粒质粒噬菌体噬菌体DNA包装成包装成功噬菌体时所必需功噬菌体时所必需的。的。质粒的复质粒的复制原点制原点可以接受可以接受1545kb的外源
18、的外源DNA细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）可以克隆可以克隆300kb左右左右片段片段酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）YAC载体可以载体可以插入大片段的插入大片段的DNA（1-2Mb）三、基因的分离三、基因的分离（一）从基因文库中分离基因（一）从基因文库中分离基因 基因文库：是由单一来源的特定组织或器官的基因文库：是由单一来源的特定组织或器官的DNADNA或或cDNAcDNA片段汇总形成的克隆群体。片段汇总形成的克隆群体。1、基因库的构建、基因库的构建基因组文库：基因组文库：全部基因组全部基因组DNADNA酶切后与载体酶切后与载体连接构建而成的连接构建而成的一个重组一个重组DN
19、ADNA群体群体 。cDNAcDNA文库文库：是以是以mRNAmRNA为模板，在反转录酶的作用下，为模板，在反转录酶的作用下，合成互补合成互补DNADNA（cDNAcDNA），将获得的双链），将获得的双链cDNAcDNA与适当载体与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增，而构建成的基因库。连接并转化到宿主细胞内进行扩增，而构建成的基因库。cDNA文库与基因组文库的不同文库与基因组文库的不同基因组文库代表了基因组中的所有基因，而基因组文库代表了基因组中的所有基因，而cDNAcDNA文库仅代表某一特定细胞类型，某一文库仅代表某一特定细胞类型，某一组织，或某一胚胎发育时期的表达序列。组织，或某一胚胎
20、发育时期的表达序列。2从基因库中分离特定的克隆序从基因库中分离特定的克隆序列列(基因基因)（1）DNA探针探针探针是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核探针是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核酸序列。利用酸序列。利用DNADNA探针可以从基因库中筛选特探针可以从基因库中筛选特定的克隆定的克隆通常探针用同位素标记，但也可使用荧光标记或通常探针用同位素标记，但也可使用荧光标记或颜色反应标记探针。探针可以有多种来源，颜色反应标记探针。探针可以有多种来源，如果筛选植物基因，探针可以来源于植物本如果筛选植物基因，探针可以来源于植物本身，也可以来源于异源植物、动物中的同类身，也可以来源于异源植物、动物中
21、的同类基因的保守序列。基因的保守序列。(2)筛选文库筛选文库（3）阳性克隆的分析与鉴定）阳性克隆的分析与鉴定从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测序才能进行生物信息分析和功能预测。，确定测定的核酸序列是不是所需测。，确定测定的核酸序列是不是所需要的基因，采用适当的软件预测它具有要的基因，采用适当的软件预测它具有什么功能。什么功能。（二）（二）T-DNA标签克隆基因标签克隆基因T-DNA 载体构建载体构建转化植物（转化植物（T1，T-DNA杂合子杂合子)收获收获T2种子种子筛选筛选T2，获突变子，应为，获突变子，应为3:1分离分
22、离确定确定T-DNA与突变型共分离的个体与突变型共分离的个体产生纯合后代产生纯合后代克隆克隆T-DNA两侧的植物两侧的植物DNA（Plasmid rescue;IPCR;Tail PCR)利用侧翼利用侧翼DNA序列作探针从该植物的序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因文库中钓取基因基因功能的验证基因功能的验证（三）（三）PCR扩增基因扩增基因（四）人工合成基因第三节第三节 外源基因的导入外源基因的导入一、重组一、重组DNA导入原核生物导入原核生物 1CaCl2处理转化：处理转化：将细菌细胞用冰上预冷的将细菌细胞用冰上预冷的CaCl2CaCl2处理，然后处理，然后转移到转移到4242的条件下
23、处理的条件下处理9090秒。秒。CaCl2CaCl2处处理转化的机制尚不清楚，可能是理转化的机制尚不清楚，可能是CaCl2CaCl2处处理破坏了细菌的细胞壁，使游离的理破坏了细菌的细胞壁，使游离的DNADNA分分子被摄入受体细胞。转化频率大概是千分子被摄入受体细胞。转化频率大概是千分之一。之一。2电激转化（电激转化（electroporation）是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆的电穿孔，以使的电穿孔，以使DNADNA分子进入细胞。进行电转分子进入细胞。进行电转化
24、操作时，细菌细胞和化操作时，细菌细胞和DNADNA分子放在带有电极分子放在带有电极的小室中，通过小室（的小室中，通过小室（chamberchamber）施加电脉冲，）施加电脉冲，使细胞壁穿孔，然后使细胞壁穿孔，然后DNADNA分子进入细胞。电转分子进入细胞。电转化的频率通常是化的频率通常是1010-6-61010-9-9，因质粒的大小而异。，因质粒的大小而异。3结合（结合（conjugation）结合是原核生物细结合是原核生物细胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一种自然过程。种自然过程。二、植物表达载体二、植物表达载体作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能：作
25、为植物基因转化的载体，必须具有两种功能：（1 1）能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中）能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组去，并且整合到宿主细胞的基因组DNADNA上；上；（2 2）能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识）能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的别的DNADNA序列，即启动子和复制子起始位点，序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。制和表达。Ti质粒质粒 致毒区 Ti 质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与 Ti 质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-
26、DNA 区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 Ti质粒是根癌农杆菌质粒是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）染）染色体外的遗传物色体外的遗传物质，为双股共价质，为双股共价闭合的环状闭合的环状DNA分子，约有分子，约有150200kb。各种不同类型的各种不同类型的Ti质粒都具有质粒都具有T-DNA区、毒性区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点碱分解位点(图图12-13)。其中以。其中以T-DNA区和毒性区和毒性区在植物转化中最为重要。区在植物转化中最为重要。T-DNA两端各有一段25bp的重
27、复序列（分别称为左边界序列和右边界序列）。T-DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的基因，称为致瘤基因，T-DNA的右端序列对T-DNA转移到植物细胞内具有重要意义。保留T-DNA两端的末端序列，然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力。致毒区 Ti 质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与 Ti 质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA 区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 T-DNA(转移转移DNA):是农杆菌侵是农杆菌侵染植物细胞时，从染植物细胞时，从Ti
28、质粒上导质粒上导入植物细胞的一段入植物细胞的一段DNA。致毒区 Ti 质粒复制起始点 冠瘿碱代谢 酶编码基因 与 Ti 质粒转移功能 有关的遗传座位 冠瘿碱合成基因 T-DNA 区 右边界 生长素合成基因 细胞分裂素合成基因 左边界 Vir区段总长度大约区段总长度大约35kb，由，由7个互补群组成，分别命名个互补群组成，分别命名为为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和和VirH。毒性。毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种：一种是区中各个位点的表达情况可以分为两种：一种是组成型组成型表达表达，即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达，即在无植物诱导分子存在下依然保持一
29、定的表达水平；另一种是水平；另一种是植物诱导型表达植物诱导型表达，即这些基因的表达必，即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达。信号分子作用下才能启动表达。Vir区段上的基因与区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关，区段上的基因传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，能够使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。故称之为毒性区。三、外源基因导入植物三、外源基因导入植物非生物载体介导的遗传转化非生物载体介导的遗传转化:种质转化系统种质转化系统和和直接转
30、化系直接转化系统统。种质转化系统是以植物自身的生殖系统种质细胞为受种质转化系统是以植物自身的生殖系统种质细胞为受体进行的转化，如体进行的转化，如花粉浸泡外源花粉浸泡外源DNA、DNA注射受粉注射受粉后的子房后的子房等；等；直接转化是采用物理或化学方法直接将外源基因导入直接转化是采用物理或化学方法直接将外源基因导入受体细胞，如受体细胞，如基因枪法基因枪法等。等。高等植物基因遗传转化的方法可以划分为两类：一高等植物基因遗传转化的方法可以划分为两类：一类是类是非生物载体介导非生物载体介导的遗传转化，另一类是的遗传转化，另一类是生物载生物载体介导体介导的遗传转化的遗传转化 三、外源基因导入植物三、外源
31、基因导入植物（一）农杆菌介导法（一）农杆菌介导法1、农杆菌介导的遗传转化需要具备的条件、农杆菌介导的遗传转化需要具备的条件（1）高效的植株再生体系）高效的植株再生体系;（2）受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。一般）受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。一般认为受体细胞应处于高度的分裂状态，只有处于分裂认为受体细胞应处于高度的分裂状态，只有处于分裂期的细胞，在期的细胞，在DNA的复制过程中，的复制过程中，T-DNA才能插入植才能插入植物基因组；物基因组；（3）应具有有效的选择系统。必须有一个理想的选择）应具有有效的选择系统。必须有一个理想的选择方法将转化细胞从非转化细胞中选择出来，得到转基方
32、法将转化细胞从非转化细胞中选择出来，得到转基因细胞系，才能保证获得转基因植株；因细胞系，才能保证获得转基因植株；（4）稳定的转化技术和基因表达。）稳定的转化技术和基因表达。2、转化方法、转化方法F1.1.共培养共培养2.2.在选择培养基上筛选在选择培养基上筛选3.3.筛选获得的抗性愈伤筛选获得的抗性愈伤 5.5.胚萌发成苗胚萌发成苗6.6.转基因植株移栽大田转基因植株移栽大田4.4.抗性愈伤分化抗性愈伤分化成胚状体成胚状体3、选择系统、选择系统抗生素抗性基因，如抗生素抗性基因，如NPTII基因（新霉素基因（新霉素磷酸转移酶基因），能分解卡那霉素等磷酸转移酶基因），能分解卡那霉素等抗生素。抗生素
33、。其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报告基因告基因如：如：GUS基因基因(-葡糖苷酸酶基葡糖苷酸酶基因因)、GFP基因等基因等。4影响转化的因素影响转化的因素农杆菌介导的遗传转化有严格的寄主限制，双农杆菌介导的遗传转化有严格的寄主限制，双子叶植物比单子叶植物容易转化。子叶植物比单子叶植物容易转化。同一种植物不同的基因型转化效率也会有所不同一种植物不同的基因型转化效率也会有所不同。农杆菌菌株、菌液浓度、植物材料的生同。农杆菌菌株、菌液浓度、植物材料的生理状态、预培养处理等都对转化效率有影响。理状态、预培养处理等都对转化效率有影响。大量的研究表明，在培养农杆菌或
34、共培养时，大量的研究表明，在培养农杆菌或共培养时，培养基中加入微量的乙酰丁香酮培养基中加入微量的乙酰丁香酮（acetosyringone）能明显提高转化效率。）能明显提高转化效率。农杆菌介导法转移的外源基因优点：与受体基因农杆菌介导法转移的外源基因优点：与受体基因组整合有一定的方向性，组整合有一定的方向性，大多数是单位点整合大多数是单位点整合，整合的外源基因基本保持其完整性。整合的外源基因基本保持其完整性。（二）基因枪介导的遗传转化（二）基因枪介导的遗传转化 基因枪法（基因枪法（gene gun），），又称生物弹法又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速
35、的金属微粒将外源基因导入活细胞的一的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。种转化技术。优点：优点：无宿主限制，可以对任何基因型材无宿主限制，可以对任何基因型材料进行转化研究。对于不能通过体细胞再料进行转化研究。对于不能通过体细胞再生植株的基因型，可以通过基因枪轰击茎生植株的基因型，可以通过基因枪轰击茎尖实现基因转化，是一种非基因型依赖型尖实现基因转化，是一种非基因型依赖型的转化技术；的转化技术；靶受体类型十分广泛，几乎包括所有具靶受体类型十分广泛，几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞；有潜在分化能力的组织或细胞；易于操作。易于操作。缺点：缺点：转化的外源基因以多拷贝居多易导转化的外源
36、基因以多拷贝居多易导致基因沉默，实验成本较高等。致基因沉默，实验成本较高等。基因枪转化原理基因枪转化原理 基因枪转化前基因枪转化前(A)(A)及转化后及转化后(B)(B)的主要部分示意图的主要部分示意图 AB12345第四节第四节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定一、一、分子检测分子检测1、PCR检测检测图图12-16 转基因棉花选择标记基因转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的编码区段的PCR扩增扩增结果（结果（M为分子量标准，为分子量标准，C为非转基因植株，为非转基因植株，P为质粒对照，为质粒对照，1-20为转基因植株）为转基因植株）2、Southern杂交M 1 2 3
37、4 5 6 7 8 9kb23.1-9.4-6.6-4.4-2.3-2.0-图图12-20转基因棉花的转基因棉花的Southern杂交检测杂交检测（M为分子量标准，为分子量标准，1为阳性对照，为阳性对照，2为阴性为阴性对照，对照，3-8为转基因植株）为转基因植株）3、Northern杂交4、Western杂交二、生物学性状鉴定二、生物学性状鉴定图图12-18 转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况转基因棉花饲喂棉铃虫时被食用情况（左图为转基因抗虫棉，右图为非转基因棉）（左图为转基因抗虫棉，右图为非转基因棉）第五节第五节 基因工程的应用基因工程的应用 一、基因工程的应用一、基因工程的应用 1、基因工程
38、是生物科学基础研究的重要手段、基因工程是生物科学基础研究的重要手段2、利用基因工程改良植物、利用基因工程改良植物转基因抗虫作物与抗除草剂作物转基因抗虫作物与抗除草剂作物 ：自从：自从19961996年转基因作物年转基因作物在生产上使用以来，转基因作物的面积迅速扩大，在生产上使用以来，转基因作物的面积迅速扩大，20032003年年转基因抗虫和抗除草剂的作物分别达到转基因抗虫和抗除草剂的作物分别达到10001000万和万和50005000万公万公顷左右。美国的转基因棉花达到总播种面积的顷左右。美国的转基因棉花达到总播种面积的80%80%左右，左右，全球的转基因棉花已达到全球的转基因棉花已达到50%
39、50%的面积。的面积。改善植物品质和抗逆性全世界每年都有超过50万的儿童因为缺乏维生素A而导致完全或不完全失明，传统的耕作方式并不能提高农作物的维生素含量，每年发达国家都投入巨额资金来开展有关的研究计划。新的转基因稻米品种富含维生素A。经过多年的研究，科学家已经把分离出的三种功能基因（两种来源于水仙花，一种来源于微生物体）嫁接到稻谷中，经过基因修饰的稻谷体内能合成大量的维生素前体胡萝卜素,而且还拥有一个漂亮的外表：它的果实呈金黄色。这种“黄金”水稻对解决热带地区儿童的维生素缺乏症意义尤为重大。4、基因工程工业、基因工程工业（1）利用转基因植物生产药物生物制药改变了传统制药的原料、工艺和生产方式
40、，使产值效应呈指数增长。生物药多为人体功能物质，例如治疗侏儒症的人生长素，常规方法是从脑下垂体提取，治疗一个病人需50具尸体；糖尿病的特效药胰岛素是从牛或猪的胰腺中提取，100原料只生产4-9g，一位患者就需40-50头猪的胰脏。随着基因表达调控研究的深入，利用植物为利用植物为生物反应器生物反应器来产生蛋白类药物和疫苗，可以提高产量而且大大降低生产成本。3、利用基因工程改良动物、利用基因工程改良动物克隆动物的成功（克隆动物的成功（1997年克隆羊多利的诞生标年克隆羊多利的诞生标志着克隆动物的成功）和转基因鱼在生产上的志着克隆动物的成功）和转基因鱼在生产上的应用是动物基因工程的典范示例。转基因动
41、物应用是动物基因工程的典范示例。转基因动物通常是将目的基因构建到载体上，然后用微量通常是将目的基因构建到载体上，然后用微量注射法将重组注射法将重组DNA导入受体合子细胞核中，借导入受体合子细胞核中，借助母体环境实现转基因动物生产。助母体环境实现转基因动物生产。植物多种多样的代谢途径产生了丰富的次生代谢产物,其中许多具药用价值。如有祛痰止咳作用的地奥素(dioscin)、有降压作用的药根碱(jatrorhizine)等。遗憾的是这些次生代谢产物往往在植物中的合成量极少,因此提取费用昂贵,限制了它们的用途。提高次生代谢产物的有效方法是把编码限速酶或具有调节功能酶的基因导入植物中。疫苗通常经微生物发
42、酵方法进行生产,尽管生产技术不断改进,由于发酵系统需要严格的培养条件以及复杂的提取过程,可食疫苗的价格始终比较昂贵。于是,人们试图利用转基因植株的可食器官生产抗原以用作口服疫苗。目前科研人员正在研究一种能供应口服维他命疫苗的香蕉，该种香蕉可用于乙型肝炎等疾病。预计这种成本相对很低的口食疫苗将对经济尚不发达的第三世界国家产生重大影响。另外这种疫苗也非常适合作禽畜的药物。（2）利用转基因植物开发新能源的途径 现在基因工程培育出一种酵母，既能分解纤维素，又耐高浓度酒精。用它来降解禾杆、废纸的纤维素为葡萄糖，进而转变为酒精。巴西由于盛产甘蔗，3/4的汽车已燃用酒精或含23%酒精的混合汽油。在以后的年代中,生物能量将占越来越重要的地位.5、疾病诊断与基因治疗、疾病诊断与基因治疗 基因治疗是利用功能基因或正常基因，通过生物基因治疗是利用功能基因或正常基因，通过生物技术手段，置换缺陷基因，从而达到矫正遗传技术手段，置换缺陷基因，从而达到矫正遗传疾病的目的。疾病的目的。6、生物工程与环境保护、生物工程与环境保护 生物治疗、废物处理、诊断和植物治疗。二、安全性评价二、安全性评价 转基因产品安全性评价转基因产品安全性评价 生态环境的安全性评价生态环境的安全性评价作业 P296 2、3、4、5（旧版）P2832、3、6、7
