1、植植物细胞培养制药物细胞培养制药意义意义药用植物是天然药物的宝库药用植物是天然药物的宝库植物细胞培养是生产的药物可能途径植物细胞培养是生产的药物可能途径目前采用植物细胞培养生产的药物主要包括目前采用植物细胞培养生产的药物主要包括 （1 1）苷（甙）类：包括皂苷（人参皂苷、三七皂苷、柴）苷（甙）类：包括皂苷（人参皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、强心苷（强心醇苷、毛地黄毒配胡皂苷、著芋皂苷等）、强心苷（强心醇苷、毛地黄毒配质衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。质衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。（2 2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆甾醇、异）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆甾
2、醇、异岩藻甾醇等。岩藻甾醇等。第1页，共121页。强心苷类（侧链为不饱和内酯环）甾醇甾醇第2页，共121页。（3 3）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。（4 4）醌类：包括蒽醌、萘醌等。）醌类：包括蒽醌、萘醌等。（5 5）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。（6 6）黄酮类：具有）黄酮类：具有C6-C3-C6C6-C3-C6结构，生物合成结构，生物合成前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A A。多为。多为治理心血管疾病和高血压的药物成分。
3、治理心血管疾病和高血压的药物成分。小檗碱小檗碱蒽醌蒽醌黄酮黄酮第3页，共121页。植植物细胞培养制药进展物细胞培养制药进展 第一个专利：第一个专利：1956 1956年年RoutinRoutin和和NickellNickell首次数提出利用首次数提出利用植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利 工业植物生物技术工业植物生物技术 ：2020世纪世纪9090年代明确提出年代明确提出 已经从已经从 200 200余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬浮余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬浮培养物（傅经国等，培养物（傅经国等，20042004）国际国际 日本日本 ：紫
4、草：紫草 人参人参 红豆杉红豆杉 欧美欧美 ：美国红豆杉；：美国红豆杉；德国德国紫锥菊紫锥菊国内：罗士韦国内：罗士韦 叶和春叶和春 郑光植郑光植 侯嵩生侯嵩生 丁家宜丁家宜 第4页，共121页。技术路线技术路线 目标植物选择目标植物选择愈伤组织诱导愈伤组织诱导液体培养液体培养培养条培养条件的优化件的优化反应器扩大培养反应器扩大培养愈伤组织诱导愈伤组织诱导固体、液体培养固体、液体培养高产细胞系筛选高产细胞系筛选生物合成途径的研究生物合成途径的研究器官分化（发状根）器官分化（发状根）固体液体培养固体液体培养条件的优化条件的优化反应器扩大培养反应器扩大培养有效有效成分提取、分离成分提取、分离第5页，
5、共121页。植物细胞培养植物细胞培养 是指在离体条件是指在离体条件下，将愈伤组织下，将愈伤组织或其它易分散的或其它易分散的组织置于液体培组织置于液体培养基中进行振荡养基中进行振荡培养，得到分散培养，得到分散成游离的悬浮细成游离的悬浮细胞，通过继代培胞，通过继代培养增殖，获得大养增殖，获得大量细胞的一种技量细胞的一种技术。术。第6页，共121页。植物细胞培养的特点:大小大小;细胞团的形式存在细胞团的形式存在;纤维素细胞壁和大液泡纤维素细胞壁和大液泡,易被剪切力损伤易被剪切力损伤;生长缓慢生长缓慢 培养基成分丰富而复杂培养基成分丰富而复杂,易被微生物污染易被微生物污染;需光需光氧氧二氧化碳二氧化碳
6、第7页，共121页。培养类型培养类型 按培养对象来说，可分为原生质体培养和单按培养对象来说，可分为原生质体培养和单细胞培养；细胞培养；按培养基类型可分为固体培养和液体培养；按培养基类型可分为固体培养和液体培养；按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养胞培养 。第8页，共121页。植物单细胞分离和初步培养 单细胞获得：单细胞获得：机械法；酶解法；愈伤组织法机械法；酶解法；愈伤组织法 单细胞培养：单细胞培养：看护培养法（看护培养法（nursing culture)饲养层培养饲养层培养(feeding layer culture)第9页，共121页。固体培养
7、固体培养 固体培养是在培养基中加入一定量的凝固固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装人培养用的容剂，经加热溶解后，分别装人培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。器中，冷却后凝结成固体培养基。优缺点优缺点简便易行、所占空间小简便易行、所占空间小 生长的不平衡，易出现了极化现象生长的不平衡，易出现了极化现象 易堆积生长过程中排出的有害物质易堆积生长过程中排出的有害物质 有些生理生化指标测定不方便有些生理生化指标测定不方便 常用的固化剂常用的固化剂 琼脂、明胶（琼脂、明胶（10%10%）等）等第10页，共121页。液体培养液体培养 1 1成批培养法成批培养法 batch cu
8、lture batch culture细胞和培养基一次性加入到培养容器或生细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养物反应器内进行培养,在培养过程中培养液在培养过程中培养液体积不变体积不变,不添加营养成分不添加营养成分,待细胞增长和产待细胞增长和产物积累到适当的时间物积累到适当的时间,一次性收获细胞一次性收获细胞 产物产物和培养液的培养方法和培养液的培养方法.第11页，共121页。液体培养液体培养 1 1成批培养法成批培养法 batch culture batch culture 特点：特点：操作简单，培养周期短操作简单，培养周期短.直接反映细胞生长代谢过程直接反映细胞生长代谢过程
9、.可直接放大可直接放大不能控制底物浓度不能控制底物浓度 细胞易老化细胞易老化 生长周期生长周期短短 效率低效率低.两步两步成批培养法成批培养法即使用两个生物反应器，第一个反应器用即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。级代谢产物的生产。第12页，共121页。2.2.半连续培养法半连续培养法 semi-continuous culture semi-continuous culture重复分批式培养或换液培养重复分批式培养或换液培养.在细胞增长和产物形在细胞增长和产物形成过程中成过程中,每间隔一段时间从中取
10、出部分培养液或每间隔一段时间从中取出部分培养液或细胞细胞,剩余的细胞作为种子剩余的细胞作为种子,再用新的培养液补足再用新的培养液补足到原体积到原体积,使生物反应器内的总体积不变使生物反应器内的总体积不变.特点特点:细胞可持续指数生长细胞可持续指数生长,并可保持产物和细胞在一较高的并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平浓度水平,培养过程中可延续很长时间培养过程中可延续很长时间.可进行多次收获可进行多次收获.操作简便操作简便,生产效率高生产效率高.第13页，共121页。3 3连续培养法连续培养法(continuous culture)(continuous culture)连续培养法是利用连续培养反
11、应器，在投料和接种培连续培养法是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。维持恒定的方法。该法的理论基础是根据该法的理论基础是根据MonodMonod公式，即生长速度取决公式，即生长速度取决于基质的浓度。于基质的浓度。maxmaxS/(Ks+S)S/(Ks+S)=特定生长速度；特定生长速度；maxmax=特定最大生长速度；特定最大生长速度；Ks=Ks=饱和系饱和系数；数；S=S=基质浓度基质浓度 两阶段连
12、续培养法两阶段连续培养法于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该培于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该培养基，而于第二反应器中投入生产培养基。养基，而于第二反应器中投入生产培养基。第14页，共121页。3 3连续培养法连续培养法(continuous culture)(continuous culture)特点特点:细胞能在近似恒定状态下生长、营养物质细胞能在近似恒定状态下生长、营养物质浓度、产物浓度、浓度、产物浓度、pHpH基本保持恒定，细胞基本保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可基本维持不变，浓度以及细胞比生长速率可基本维持不变，细胞维持持续指数增长。细胞维持持续指数增长。稳定状态可
13、有效地延长分批培养中的对数稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。生长期。第15页，共121页。3 3连续培养法连续培养法(continuous culture)(continuous culture)问题问题:一直有细胞收获，浓度一般不高一直有细胞收获，浓度一般不高 细胞分裂快、易变异；细胞分裂快、易变异；由于是开放式操作，加上培养周期较长，由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染容易造成污染 对设备、仪器的控制技术要求较高。对设备、仪器的控制技术要求较高。第16页，共121页。悬浮培养悬浮培养（Suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个悬浮培养
14、是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。养增殖的技术。特点特点 1.培养细胞可不断增殖，且生长速度快。培养细胞可不断增殖，且生长速度快。2.液体状态下便于细胞和营养物质的充分接液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致。触和交换，细胞状态可以相对保持一致。第17页，共121页。细胞悬浮培养的建立细胞悬浮培养的建立愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导悬浮系的建立与继代培养悬浮系的建立与继代培养悬浮细胞的生长动态悬浮细胞的生长动态悬浮细胞同步化悬浮细胞同步化第18页，共121页。愈伤组织的诱导愈伤组
15、织的诱导 选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的附加物质。附加物质。第19页，共121页。要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎状，疏松易碎第20页，共121页。悬浮系的建立与培养悬浮系的建立与培养callus150250ml flaskcentrifuge isolationsubculture1g/10ml medium100120 rm
16、p culture transfer 1 time/3d80 rpm第21页，共121页。第22页，共121页。成功的悬浮细胞培养体系特征 悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在在3050个细胞以下。个细胞以下。均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。淡黄色。细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天便可增加一倍。天便可增加一倍。第23页，共12
17、1页。第24页，共121页。第25页，共121页。悬浮细胞的生长动态第26页，共121页。悬浮细胞生长的衡量 根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。质量变化。生长速率生长速率(p)：不同时间细胞密度：不同时间细胞密度(x)的自然的自然对数与起始密度对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养的自然对数之差与培养时间时间(t)的比值的比值p(lnx-lnx0)/t 鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况长情况 干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量第27页，共121页。影响悬浮细胞
18、生长的因素 起始愈伤组织的质量起始愈伤组织的质量 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在在0.52.5105个细胞个细胞/毫升。接种初期的毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有最低有效密度效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。种量。培养条件：培养基、方式、温度、继代周培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。期。第28页，共121页。影响悬浮细胞生长的因素 培养基培养基应用应用条件培养基条件培养基（生长过愈伤组织或悬（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长浮细胞的液体培
19、养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。和分裂所需的特殊代谢物。基本培养基成分的调节视不同的培养目基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定的而定 培养基设计时培养基设计时,一般均以诱导愈伤一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有用的培养基有MS、B5、LS、N6等。等。植物激素和其他附加成分的应用。植物激素和其他附加成分的应用。第29页，共121页。影响悬浮细胞生长的因素 培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养式）；分批培养，半连续培养和连续培养 温度温度 25 继
20、代周期继代周期指具有一定起始密度的细胞指具有一定起始密度的细胞,从开始培养到细胞从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。数目和总重量增长停止的一个过程。培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。长短、生长速率等决定。继代培养（继代培养（SubcultureSubculture）：继初代培养之后的：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。连续数代的扩繁殖培养过程。第30页，共121页。悬浮培养细胞的同步化 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。胞都同时通过细
21、胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。步化是十分困难的。同一培养体系的植物细胞经常不能处于同同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。代谢以及生理生化状态等复杂化。通过一定的理化措施可以使同一体系中的通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。细胞达到相对同步化。什么措施？什么措施？第31页，共121页。细胞周期细胞周期 第32页，共121页。
22、饥饿法 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成能合成DNA，即不能进入，即不能进入S期，或细胞分裂期，或细胞分裂不能进行，即不能进入不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥期。因此，通过饥饿法可以获得处于饿法可以获得处于G1和和G2期的同步化细胞。期的同步化细胞。氮饥饿时，通常获得氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞期的同步化细胞磷和碳饥饿时，获得磷和碳饥饿时，获得G1和和G2期的同步化期的同步化细胞。细胞。将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。细胞分裂又可重新恢复。第33页，共121页。抑制剂法
23、 通过一些通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。的同步化细胞。常用抑制剂主要有常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷氟脱氧尿苷(FudR)和羟基和羟基尿尿(HU)。用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较
24、的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。小。第34页，共121页。分选法 依据：细胞体积大小依据：细胞体积大小 方法方法 常规分选方法是梯度离心常规分选方法是梯度离心 精细的分选可采用流式细胞仪精细的分选可采用流式细胞仪 优点优点 操作简单操作简单 分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用带来的副作用 缺点缺点 分选精细度较差分选精细度较差第35页，共121页。低温处理 可以提高培养体系中细胞同步化的程度可以提高培养体系中细胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。胞较好地同步
25、化。梅兴国等（梅兴国等（2001）采用）采用6低温处理红豆低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。杉细胞也获得较明显同步化效果。可能的原因可能的原因不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。细胞同步化率升高。第36页，共121页。单细胞培养 意义意义 分离方法分离方法机械法机械法酶解法酶解法 培养方法培养方法平板培养平板培养看护培养
26、看护培养微室培养微室培养双层滤纸培养双层滤纸培养第37页，共121页。单细胞分离方法单细胞分离方法 机械法机械法 具体做法：具体做法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 优点：优点：细胞不受酶伤害；细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。有利于进行细胞的生理和生化研究。第38页，共121页。单细胞分离方法单细胞分离方法 酶解法酶解法酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘
27、露醇等渗透压保用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。游离细胞的产量。酶解法的优点酶解法的优点可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。科植物叶片效果不好）。第39页，共121页。细胞平板培养（细胞平板培养（plating culture)指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首首创创单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞
28、团不能超过团不能超过6个细胞。个细胞。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤基洗涤2次以后，调整密度为次以后，调整密度为5103个个/毫升毫升植板：将植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液份已调整好密度的单细胞悬浮液与与4份份35的固体培养基充分混合均匀，然的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。左右。第40页，共121页。细胞平板培养（细胞平板培养（plating culture)平板培养的效果一般用植板率来衡量。植平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单
29、细板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数每个平板形成的细胞团数植板率植板率 每个平板接种的细胞总数每个平板接种的细胞总数第41页，共121页。细胞平板培养（细胞平板培养（plating culture)优点：优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、作简便等优点，被广泛应用于
30、细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。成毒害或影响组织吸收。第42页，共121页。细胞悬浮细胞悬浮过滤过滤与培养基与培养基混合混合植板植板培养培养克隆愈克隆愈伤组织伤组织第43页，共121页。看护培养（nurse culture）Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。过程。
31、第44页，共121页。第45页，共121页。微室培养微室培养(microchamber culture)在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。由形成细胞团的方法。由Jones等在等在1960年年设计的。设计的。优点：可对培养细胞连续进行显微观察，优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程 缺点：培养基少，营养和水分难以保持，缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。变动幅度大
32、，培养细胞仅能短期分裂。细胞起始密度：细胞起始密度：3080个个/室。室。第46页，共121页。第47页，共121页。双层滤纸植板培养 Horsch等（等（1980）建立）建立培养皿培养皿培养基培养基饲养细胞层饲养细胞层培养细胞培养细胞 看护滤纸看护滤纸转移滤纸转移滤纸第48页，共121页。固定化培养法固定化培养法 将细胞限制或定位于特定空间位置的培养将细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术称为细胞固定化培养。技术称为细胞固定化培养。固定化培养采用的固定化反应器有网状多固定化培养采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型，孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型，将细胞固定于尼
33、龙网套内，或固定于中空将细胞固定于尼龙网套内，或固定于中空纤维反应器的膜表面，或固定于网状多孔纤维反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放入培养液中进行培养，或连续流板上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集入新鲜培养液，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。第49页，共121页。与悬浮培养相比，固定化培养的优点：与悬浮培养相比，固定化培养的优点：提高了药物的合成、积累提高了药物的合成、积累；能长时间保持细胞活力；能长时间保持细胞活力；可以反复使用；可以反复使用；抗剪切能力强抗剪切能力强；耐受有毒前体物质
34、的浓度高；耐受有毒前体物质的浓度高；遗传性状较稳定；遗传性状较稳定；后处理难度小。后处理难度小。第50页，共121页。固定化植物细胞培养技术要进入工业化生固定化植物细胞培养技术要进入工业化生产有许多问题尚待解决。产有许多问题尚待解决。首先，固定化培养要求代谢产物必须是首先，固定化培养要求代谢产物必须是分泌到细胞外的。分泌到细胞外的。第二，植物细胞药物的积累是不连续的，第二，植物细胞药物的积累是不连续的，这也限制了固定化细胞方法的应用。这也限制了固定化细胞方法的应用。第三，易污染。第三，易污染。Flash第51页，共121页。植物细胞规模化培养植物细胞规模化培养 规模化培养体系的建立规模化培养体
35、系的建立 生生 物物 反反 应应 器器 规模化培养的技术问题规模化培养的技术问题第52页，共121页。植物细胞大规模培养的技术要求植物细胞大规模培养的技术要求 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物生长和生产的生物反应器，建立最宜于植物生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统；佳的控制和调节系统；从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。量恒定的产物。细胞生长速度快，短时间内能生产较多产物细胞生长速度快，短时间内能生产
36、较多产物产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中第53页，共121页。植物细胞规模化培养体系的建立植物细胞规模化培养体系的建立 种子细胞选择种子细胞选择 种子细胞增殖与放大培养种子细胞增殖与放大培养 大规模培养体系建立大规模培养体系建立第54页，共121页。种子细胞选择种子细胞选择 外植体选择外植体选择植物类型：遗传基础。在确定生产某一植物类型：遗传基础。在确定生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及品种能够产生目的化合物的植物种类及品种或单株。或单株。组织器官：由于天然产物一般为次生代组织器
37、官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物次生代谢产物的积累具谢产物，而植物次生代谢产物的积累具有组织器官的特异性，因此，在起始细有组织器官的特异性，因此，在起始细胞培养时尽量选择自然状态下产生天然胞培养时尽量选择自然状态下产生天然产物的器官、组织作为外植体。产物的器官、组织作为外植体。第55页，共121页。种子细胞选择种子细胞选择 高产细胞系的筛选高产细胞系的筛选悬浮细胞系悬浮细胞系单细胞克隆单细胞克隆种细胞增殖种细胞增殖第56页，共121页。种子细胞增殖与放大培养种子细胞增殖与放大培养 目的目的准备材料准备材料提供技术参数提供技术参数 过程过程摇瓶摇瓶反应器反应器第57页，共121页。大规
38、模培养体系的建立大规模培养体系的建立 培养方式培养方式成批培养、连续培养和半连续培养。成批培养、连续培养和半连续培养。培养方式的选择培养方式的选择根据次生产物积累而定，通常还根据不根据次生产物积累而定，通常还根据不同要求进行改进。如当细胞生长和产物同要求进行改进。如当细胞生长和产物合成需要不同的培养基时，就需要采用合成需要不同的培养基时，就需要采用两步法培养，先在细胞生长培养基中培两步法培养，先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，将其转至产物合成培养基中的阶段后，将其转至产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可采用连续培培养，在产物
39、合成阶段又可采用连续培养方式以延长细胞生产时间。养方式以延长细胞生产时间。第58页，共121页。生物反应器类型及特点生物反应器类型及特点 是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。其相应控制系统。适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的适合植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。搅拌式搅拌式 气动式气动式 固定化式固定化式 其它其它光照生物反应器，转鼓式光照生物反应器，转鼓式第59页，共121页。反应器类型反应器类型 体积（体积（L）培养植物种类培养植物种类搅拌式搅拌式7，15D.
40、carota 胡萝卜胡萝卜搅拌式搅拌式20，15500N.tabacum 烟草烟草搅拌式搅拌式5000C.roseus 长春花长春花螺旋搅拌式螺旋搅拌式 20C.blumei 五彩苏五彩苏提升搅拌式提升搅拌式 2.5P.elliotii 湿地松湿地松鼓泡式鼓泡式20，30，130P.ginseng 人参人参鼓泡式鼓泡式65，1500N.tabacum 烟草烟草外环气升式外环气升式 10，30，85C.roseus 长春花长春花导筒气升式导筒气升式 20，210D.lanata 狭叶毛地黄狭叶毛地黄转鼓式转鼓式14V.rosea 长春花长春花植物细胞培养生物反应器植物细胞培养生物反应器第60页，
41、共121页。搅拌式反应器搅拌式反应器 是根据植物细胞特性在微生物发酵罐基础上是根据植物细胞特性在微生物发酵罐基础上改进而成。改进而成。搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式。式。必须设计加液装置必须设计加液装置 必须设计通气装置必须设计通气装置 适宜的取样口适宜的取样口第61页，共121页。第62页，共121页。气动式反应器气动式反应器 又称空气提升式反应器又称空气提升式反应器 特点：剪切力小，但搅拌不很均匀。特点：剪切力小，但搅拌不很均匀。Flash第63页，共121页。固定化反应器固定化反应器 特点：特点：较容易地控制培养系统的理化环境，可以研较容易
42、地控制培养系统的理化环境，可以研究特定的代谢途径，便于调节。究特定的代谢途径，便于调节。细胞位置的固定使其所处环境类似于在植物细胞位置的固定使其所处环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可形成体中所处的状态，相互间接触密切，可形成一定的理化梯度，有利于次生产物合成。一定的理化梯度，有利于次生产物合成。可以从培养基中提取产物，免除了培养基中可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因初级代谢产物积累造成对代谢的反馈抑制，因初级代谢产物积累造成对代谢的反馈抑制，延长生产周期，进行连续生产。延长生产周期，进行连续生产。第64页，共121页。固定化反应器固定化反应器 种类：种类：主要有流化床、膜
43、反应器和填充反应器主要有流化床、膜反应器和填充反应器 植物细胞固定化一般采取凝胶包埋、膜固定、植物细胞固定化一般采取凝胶包埋、膜固定、网格和泡沫固定和表面吸附等。网格和泡沫固定和表面吸附等。包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等附着式固定化培养系统：支持物多采用尼附着式固定化培养系统：支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫和中空纤维等。龙网、聚氨酯泡沫和中空纤维等。第65页，共121页。Alfermann等等(1983)用气升式系统，采用海用气升式系统，采用海藻钙固定细胞成功地用藻钙固定细胞成功地用30
44、L和和200 L的反应的反应器生产地高辛。器生产地高辛。Jose等等(1983)进一步用中空纤维反应器培进一步用中空纤维反应器培养胡萝卜和碧东茄生产代谢产物酚类物质养胡萝卜和碧东茄生产代谢产物酚类物质 Mavituna等等（1987）使用板式反应器和循使用板式反应器和循环床反应器培养固定化辣椒细胞，最大辣环床反应器培养固定化辣椒细胞，最大辣椒素生产速率（以干辣椒细胞计）达到椒素生产速率（以干辣椒细胞计）达到0.5mg0.5mgg gd d，与成熟期辣椒合成辣椒素的，与成熟期辣椒合成辣椒素的速率相当。速率相当。第66页，共121页。规模化培养中有关工程技术问题 悬浮培养系统必须适应植物细胞特性悬
45、浮培养系统必须适应植物细胞特性细胞体积大。其平均直径比细菌大几十倍细胞体积大。其平均直径比细菌大几十倍通常以通常以2200个细胞，直径个细胞，直径2mm大小的非大小的非均匀小细胞团形式存在。均匀小细胞团形式存在。抗剪切能力弱。抗剪切能力弱。生长速度慢，周期长，培养基成分复杂，有生长速度慢，周期长，培养基成分复杂，有利于微生物生长，因此在培养中维持无菌环利于微生物生长，因此在培养中维持无菌环境难度较大但又十分重要。境难度较大但又十分重要。第67页，共121页。规模化培养中有关工程技术问题 培养液的流变特性粘度变化培养液的流变特性粘度变化是由细胞密度和细胞状态变化造成的是由细胞密度和细胞状态变化造
46、成的烟草细胞培养，当细胞密度低于烟草细胞培养，当细胞密度低于7g/L时，培养液粘度基本不变，而高于此时，培养液粘度基本不变，而高于此值时，培养液粘度增加。值时，培养液粘度增加。长春花细胞培养密度在长春花细胞培养密度在10g/L时，培养时，培养液粘度有赖于细胞年龄、形态和细胞液粘度有赖于细胞年龄、形态和细胞团大小。团大小。在相同物质浓度下在相同物质浓度下,大细胞团的营养液表大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团的表观粘度。观粘度明显大于小细胞团的表观粘度。第68页，共121页。规模化培养中有关工程技术问题 氧气含量调节氧气含量调节KLa（氧的传递系数，（氧的传递系数，Nv=Kla(C*-C)）
47、：）：如在如在4L的气升式反应器中进行长春花细胞培养的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，时，KLa在在20h-1左右时。细胞生长与次生产物合成左右时。细胞生长与次生产物合成维持在良好状态；维持在良好状态；在在15L通风式反应器中培养的烟草细胞，当通风式反应器中培养的烟草细胞，当KLa在在510h-1的范围内，生物量和代谢产物随的范围内，生物量和代谢产物随KLa增加而增增加而增加。加。溶氧浓度：毛地黄细胞培养，当培养基氧浓度从溶氧浓度：毛地黄细胞培养，当培养基氧浓度从10饱和度上升至饱和度上升至30，细胞生长速率从，细胞生长速率从0.15d-1上升至上升至0.20d-1，如果继续上升至，如果继
48、续上升至 40，细胞生长速率反，细胞生长速率反而下降至而下降至0.17d-1。第69页，共121页。规模化培养中有关工程技术问题 CO2调节调节 在通气过程中，混入在通气过程中，混入24的的CO2能消能消除高通气速率对长春花细胞生长和次生代除高通气速率对长春花细胞生长和次生代谢产物合成的不利影响。谢产物合成的不利影响。第70页，共121页。规模化培养中有关工程技术问题 泡沫和表面黏附性泡沫和表面黏附性植物细胞培养中易产生泡沫，且覆盖蛋白植物细胞培养中易产生泡沫，且覆盖蛋白质和粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循质和粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来，形成非均相培养而环的培养液中带出
49、来，形成非均相培养而影响培养系统的稳定性和生产率。影响培养系统的稳定性和生产率。消除方法消除方法化学消泡：天然油脂、高级醇类、聚醚类化学消泡：天然油脂、高级醇类、聚醚类机械消泡机械消泡第71页，共121页。提高植物细胞药物产量的途径 选择适宜的起始材料种类、部位选择适宜的起始材料种类、部位栀子（栀子（Gardenia jasminoidesGardenia jasminoides）胚轴）胚轴 银杏银杏 子叶子叶 当归当归 根根 红豆杉红豆杉 幼嫩的茎幼嫩的茎茜草茜草 叶柄叶柄 第72页，共121页。高产细胞株的筛选直接筛选法直接筛选法 红豆杉红豆杉 紫杉醇紫杉醇玫瑰茄玫瑰茄 花色苷（比对照提高
50、花色苷（比对照提高14.514.5倍）倍）诱变育种法诱变育种法伊贝母紫外光伊贝母紫外光黄连黄连 6060Co Co（小檗碱含量达（小檗碱含量达6.12%6.12%）红豆杉红豆杉 苯丙氨酸苯丙氨酸第73页，共121页。高产细胞株选择选择 梅兴国（梅兴国（2001）通过在培养基中添加）通过在培养基中添加1.6mM的的L-Phe，筛选出了抗，筛选出了抗Phe的红豆杉的红豆杉细胞悬浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞细胞悬浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞35倍。倍。第74页，共121页。产生等于或高于亲本植物药物含量的植物细胞培养系统产生等于或高于亲本植物药物含量的植物细胞培养系统 植物种类植物种类培 养培
