1、小小鼠鼠骨骨髓细胞染色体畸变髓细胞染色体畸变1毒理学动物实验的背景毒理学动物实验的背景毒理学毒理学实验学科实验学科整体动物实验整体动物实验原则原则：对实验动物的作用可以外推于人；对实验动物的作用可以外推于人；暴露剂量暴露剂量(高剂量阳性模高剂量阳性模型型)；暴露途径暴露途径(与人实与人实际相同际相同/相似相似)。应用：毒性评价试验应用：毒性评价试验一般毒性试验一般毒性试验：急性毒性急性毒性，局部毒性，慢性毒性等；，局部毒性，慢性毒性等；特殊毒性试验：致癌，致畸，致突变等特殊毒性试验：致癌，致畸，致突变等机制研究机制研究(转基因动物转基因动物)毒理学动物实验进展和趋势：毒理学动物实验进展和趋势：
2、转基因动物转基因动物模型模型从体内试验从体内试验(in vivo)体外试验体外试验(in vitro)从整体动物试从整体动物试验验3R替代试验替代试验微核试验微核试验 染染色体畸变试验色体畸变试验 精精子畸形试验子畸形试验 Ames试验，等试验，等2 2微核试验回微核试验回顾顾31 1讨论微核试验结果：重点（数讨论微核试验结果：重点（数了了PCE/NCE、多、多少少PCE有微有微核核）2 2骨髓采集问题骨髓采集问题3 3染色问题，比值染色问题，比值偏偏高高4 4固定的问题，细胞数量太少固定的问题，细胞数量太少5 5针针对对结果要进行分析结果要进行分析6 6思考思考题题要认真对待要认真对待染色体
3、畸变试验原理染色体畸变试验原理观察观察染色体形态结构和数目改染色体形态结构和数目改变变称为染色体畸变分析，又称称为染色体畸变分析，又称 细胞遗传学试验。细胞遗传学试验。优点：将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜直接检优点：将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜直接检 查查染色体畸变染色体畸变和和染色体分离异染色体分离异常常。可以观察到。可以观察到裂隙、断裂、裂隙、断裂、短片、无着丝粒环、染色体环、双或多着丝粒染色体、染色短片、无着丝粒环、染色体环、双或多着丝粒染色体、染色 体粉碎体粉碎等。等。缺点是分裂中期相分析耗时并且需要熟练技巧缺点是分裂中期相分析耗时并且需要熟练技巧45染色体染色体
4、皱缩皱缩 形态明显形态明显6小鼠小鼠染色染色体体数目数目、核型核型7端着丝端着丝粒染色体粒染色体实验目的及意义目的：目的：掌握掌握动物骨髓细胞染色动物骨髓细胞染色体体标本制作方法标本制作方法了解了解动物体内染毒及染动物体内染毒及染色色体畸变常见类体畸变常见类型型意义：意义：检测检测受试受试物物导致导致动动物染物染色色体畸体畸变变的能的能力力和和 畸变畸变类型类型8实验动物选择与处理实验动物选择与处理1.动物动物一般选用成年大鼠一般选用成年大鼠或或小鼠小鼠，每组，每组6-10只，最好雌雄各半；只，最好雌雄各半；死死动动3应应以以照注照注腹腹射射 腔腔.染毒与取样时间染毒与取样时间一般染毒一次或多
5、次，多次更合理。末次染毒一般染毒一次或多次，多次更合理。末次染毒后后24h处处 物，收获细胞物，收获细胞.剂量剂量最高剂量为最大耐受剂量最高剂量为最大耐受剂量或或30%-80%LD50。低毒物质。低毒物质 最大给药量或人使用剂量最大给药量或人使用剂量的的50-100倍。倍。设设3-5个剂量组，剂量阔度个剂量组，剂量阔度在在100-1000或更大。阴性对或更大。阴性对 溶剂或生理盐水；阳性对照注溶剂或生理盐水；阳性对照注射射30-50mg/kg环磷酰胺环磷酰胺，经，经 注射注射1或或2次。次。4.给药途径给药途径 原则上采用与人体接触化学毒物相同的途径。原则上采用与人体接触化学毒物相同的途径。9
6、2 1.共共20只昆明雌鼠（只昆明雌鼠（20g左右左右）2.阳阳性性物：环磷酰胺，物：环磷酰胺，40mg/kg受试物：丙烯酰受试物：丙烯酰胺胺1/8,1/4,1/2 LD50(180mg/kg)3.一一次染毒次染毒14:00、腹腔注射、腹腔注射，24h后处死小后处死小鼠鼠4.分分组组：分：分5组组 每组每组4只小鼠，只小鼠，2名学生共一只名学生共一只实验流程总图实验流程总图收获细胞收获细胞：处：处死，死，取股取股骨骨，4ml 4ml PBS PBS 冲冲 洗洗 ，1500r/min1500r/min10min10min，弃弃 上清，轻轻倒置沥干上清，轻轻倒置沥干低渗低渗：轻柔打散，加入：轻柔打
7、散，加入0.070mol/L 0.070mol/L KClKCl 6ml6ml，3737低渗低渗30-35min30-35min，第，第 10mi10min n，以，以枪头吹气泡的方枪头吹气泡的方式式再次混再次混 匀细胞悬液匀细胞悬液，加加2ml2ml固固定定液液，1000r/min1000r/min10min10min，弃上清弃上清，余，余 0.2ml0.2ml液体液体固定固定：4ml4ml固定液轻固定液轻柔柔混匀混匀，室温室温静静 置置15min15min，1000r/min1000r/min离心离心10min10min，再重复一次，留再重复一次，留约约0.1-0.2ml0.1-0.2ml
8、液体液体制片染色制片染色：混匀细胞，悬滴：混匀细胞，悬滴于于冰冻载冰冻载 玻片，晾干，姬姆萨快速染玻片，晾干，姬姆萨快速染色色试剂盒试剂盒 染色，清洗晾干染色，清洗晾干阅阅片片：低倍镜：低倍镜 找良好视野，找良好视野，换油镜观察换油镜观察重要重要2424h h前前腹腔注射腹腔注射受试物受试物2-4h2-4h前前腹腔注射腹腔注射秋水仙素秋水仙素24.5h24.5h称重、分组称重、分组KClKCl需要需要 提前预热提前预热1010体体重重、分组、分组和和注射体积表注射体积表111112腹腔注射要点？1314尽量向脊尽量向脊柱处剪断柱处剪断15本试验本试验：PBS也可用：滤纸也可用：滤纸1.1.移液
9、器移液器吸取吸取5mlPBS置置于离于离 心管中心管中2.2.注射器注射器反复吸反复吸取取PBS冲洗冲洗3.3.第二只股骨第二只股骨用同一用同一PBS16 自自-20冰箱冰箱60%乙醇乙醇溶溶液液中，中，取取出玻出玻 片片 25-40cm高度滴片，高度滴片，玻片倾玻片倾斜斜30 每个标本制每个标本制备备2-3张片张片滴片 做好标记做好标记 自然晾干自然晾干（可以借助吹可以借助吹风风机）机）染色染色（同微（同微核试核试验验）阅阅片片：一只小鼠找：一只小鼠找到到200分裂相，分裂相，观察记录畸观察记录畸变种类，计变种类，计算算畸变率畸变率17染色染色取吉姆萨染取吉姆萨染液液A液液，滴加滴加载载玻玻
10、片片1 滴，立即滴，立即取取B液液，顺序滴，顺序滴加加16滴滴，吸，吸 耳球吹匀耳球吹匀AB液液，静置静置10min自来自来 水背面冲洗水背面冲洗载玻载玻片片，晾干，晾干阅片观察阅片观察细胞未破裂的中期分结构异常和数低倍镜下选择分散良好，裂相，油目异常细镜下观察并记录染色体胞。低倍低倍 镜镜高倍高倍 镜镜油镜油镜18192021染色体数目计数试剂试剂环磷酰环磷酰胺：胺：40mg/kg（2mg/ml）秋水仙秋水仙素素：4mg/kg(0.2mg/ml)缓冲液缓冲液：PBS（pH7.4）低渗液低渗液：0.07mol/L KCl固定液固定液：甲醇：甲醇3份冰醋份冰醋酸酸1份（份（30ml甲甲醇醇+10
11、ml冰醋酸）冰醋酸）染色剂染色剂：姬姆萨快姬姆萨快速染色试剂盒速染色试剂盒2222；动物动物天天平平3台台；光学显微镜光学显微镜，20台台 水水浴浴锅一锅一台台；15ml离离心心机机2台；台；100-1000ml移液器，移液器，配枪配枪头头一一盒盒器具23乳胶手套乳胶手套1副副/人人酒精棉酒精棉球及干棉球球及干棉球 若干若干搪瓷盘搪瓷盘1个个/人人直头眼直头眼科剪科剪1把把/人人眼科镊眼科镊1把把/人人滤纸滤纸若干若干10ml离心管离心管1支支/人人，PBS用用50ml离心管离心管1支支/组，组，固定液新鲜配制固定液新鲜配制离心管架离心管架15ml离心离心管管100ml量筒量筒1支支/组，组，
12、配固定液配固定液1ml注射器注射器1人人/支支载玻片载玻片（冰片）（冰片）45张张，60%酒精浸泡酒精浸泡，-20备用备用胶头滴管胶头滴管2支支/组组玻璃染玻璃染色缸及片架色缸及片架 2个，浸个，浸泡冰片用泡冰片用晾片架晾片架一组学一组学生共生共用用一个一个，全，全班班5个个玻璃铅笔玻璃铅笔1支支/组组25ml滴瓶滴瓶2瓶瓶/组组，AB液液洗耳洗耳球球3个个/组组，共，共12个个120mm培养皿培养皿2个个/组组，共，共8个个60ml滴瓶滴瓶2瓶，香瓶，香柏油、拭镜液柏油、拭镜液镜头纸镜头纸1本，全班本，全班实验报告 1.实验目的实验目的意义；意义；2.实验动实验动物物情况、受试物名称、浓度；
13、情况、受试物名称、浓度；3.实验动物实验动物体重、随机分组、注射体积和时间；体重、随机分组、注射体积和时间；4.实验操作实验操作步骤；步骤；5.记录染色体畸变的种类和计算每张片子、每组平均畸变率；记录染色体畸变的种类和计算每张片子、每组平均畸变率；6.讨论讨论实实验中关键步骤和细节对结果的影响。验中关键步骤和细节对结果的影响。思考题：思考题：1.比较染色比较染色体畸变和微核试验两者目的意义和方法上的异同体畸变和微核试验两者目的意义和方法上的异同2425实验流程总图实验流程总图收获细胞收获细胞：处：处死，死，取股取股骨骨，5ml 5ml PBS PBS 冲冲 洗洗 ，1500r/min1500r
14、/min5min5min，弃弃 上清，轻轻倒置沥干上清，轻轻倒置沥干低渗低渗：轻柔打散，加入：轻柔打散，加入0.070mol/L 0.070mol/L KClKCl 6ml6ml，3737低渗低渗30-35min30-35min，第，第 10mi10min n，以，以枪头吹气泡的方枪头吹气泡的方式式再次混再次混 匀细胞悬液匀细胞悬液，加加2ml2ml固固定定液液，1500r/min1500r/min5min5min，弃弃上上清，清，余余 0.2ml0.2ml液体液体固定固定：4ml4ml固定液轻固定液轻柔柔混匀混匀，室室温温 5min5min，1500r/min1500r/min离离心心5mi
15、n5min，再重再重 复复一次，留一次，留约约0.2ml0.2ml液体液体制片染色制片染色：混匀细胞，悬滴：混匀细胞，悬滴于于冰冻载冰冻载 玻片，晾干，姬姆萨快速染玻片，晾干，姬姆萨快速染色色试剂盒试剂盒 染色，清洗晾干染色，清洗晾干阅阅片片：低倍镜：低倍镜 找良好视野，找良好视野，换油镜观察换油镜观察重要重要2424h h前前腹腔注射腹腔注射受试物受试物2-4h2-4h前前腹腔注射腹腔注射秋水仙素秋水仙素24.5h24.5h称重、分组称重、分组KClKCl需要需要 提前预热提前预热26261.1.移液器吸移液器吸取取5 5mmlPBSlPBS置置于于 离心管中离心管中2.2.注射器反复吸注射
16、器反复吸取取PBSPBS冲冲洗洗3.3.第二只股骨用同第二只股骨用同一一PBSPBS27 自自-20冰箱冰箱60%乙醇乙醇溶溶液液中，中，取取出玻出玻片片 15-25cm高度滴片高度滴片，玻片倾，玻片倾斜斜30 每个标本制每个标本制备备2-3张片张片 做好标记做好标记 自然晾干自然晾干（可以借助吹可以借助吹风风机）机）染色染色（同微（同微核试核试验验）滴片 阅阅片片：一只小鼠找：一只小鼠找到到200分裂相，分裂相，观察记录畸观察记录畸变种类，计变种类，计算算畸变率畸变率28染色染色取吉姆萨染取吉姆萨染液液A液液，滴加滴加载载玻玻片片1 滴，立即取滴，立即取B液液，顺，顺序序滴滴加加16滴滴，吸，吸 耳球吹匀耳球吹匀AB液液，静置静置10min自来自来 水背面冲洗水背面冲洗载玻载玻片片，晾干，晾干293031染色体畸变类型20对整数倍对整数倍增加和增加和减少的减少的染色体染色体数数目目相相等等32染色体数目畸变超二倍体超二倍体亚二倍体亚二倍体33染色体结构改变-缺失34染色体结构改变-倒位染色体结构改变-易位相相互互3易易5位位36罗伯逊罗伯逊易位易位37染色体结构改变-重复38染色体结构改变-双着丝粒
