1、 组织细胞培养技术授课教师 左 丽 贵阳医学院免疫学教研室 2008年4月10日第三章 培养用液 培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。主要包括平衡盐溶液、常用试剂及培养基三大类，培养基又分为天然培养基与合成培养基.平 衡 盐 溶 液（b a l a n c e d s a l t solution，BSS）具有维持渗透压，调控酸、碱平衡的作用，并可供细胞生存所需的能量和无机离子成分，另外尚可用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。常用试剂是制备细胞、培养细胞及检查细胞所必需的，为细胞培养提供了方便、有利的条件。w 水不仅是细胞的主要成分，也是细
2、胞赖以生存的主要环境，营养物质、代谢产物都必须溶解在水中，才能被细胞吸收和排泄。体外培养细胞对水的质量非常敏感，要求很高。水的纯度不够,即使有害元素含量极少对细胞也会产生不利的影响，有时引起细胞中毒死亡。因此配制所有的培养液和各种溶液应使用纯化水。组织培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水。二次蒸馏水或一次蒸馏水可用以清洗器皿或配制一般洗液。w 离子交换水装置 此装置用离子交换树脂可有效地去除离子，所制得的水称为去离子水。制取去离子水不用燃料、成本低、水质好、操作简便，但不能去除非离子物质或有机物质，因此组织培养中很少使用，仅用于冲洗玻璃器皿等。w 二、蒸馏水装置 玻璃蒸馏器制取的蒸馏水符合组
3、织培养的要求，因用金属蒸馏器不能完全排除金属离子，故不符合要求。有时为制取大量高质纯化水，可用去离子水经玻璃蒸馏器重蒸,组织培养用液需用三蒸水配制。蒸馏水一般是现用现制，存放时间不宜太长，最好不要超过两周。因空气中的杂质和有毒气体能污染水质，CO2也会溶解于水，故存放时要将蒸馏水装满贮存容器，密封瓶口防止空气混入。第二节平衡盐溶液w 平衡盐溶液（BSS）主要是由无机盐和葡萄糖组成，其中无机离子是细胞生命的必要成分；在维持渗透压、缓冲和调节溶液pH方面也起着重要作用。Ca2+、Mg2+能为酶系统的活化提供条件，也是细胞膜的重要组成成分。葡萄糖等可为细胞代谢提供能量。BSS内还含有少量的酚红，作为
4、pH变化的指示剂，溶液变酸性时呈黄色，变碱性时呈紫红色，中性时呈桃红色。w 目前最常用的BSS是Hanks液、Eagle液和PBS等。在细胞培养中，BSS用途如下：（1）作为配制培养基的基础溶液：（2）配制各种试液：如配“胰酶”消化液。（3）用于洗涤组织和细胞。w 配制要求:（l）要防止钙的沉淀：应将其中的CaC12单独配制，并将平衡盐溶液配成浓缩液，使其在稀释前不让Ca+与PO42-和CO32-接触，以免产生不溶解的CaPO4和CaCO3。避免产生CaCO3的方法是将Na2CO3单独配制，使用时现加。（2）要有良好的缓冲作用：Hanks液和Earle液都需一定量的CO2平衡。因此应将瓶盖（橡
5、皮塞）盖紧，以防瓶中CO2逃逸，使溶液pH增高。pH调整液单独灭菌时，亦应将瓶盖塞紧，否则NaHCO3受热分解为NaOH和CO2，失去其调节pH之功能。w 为了便于保存和减少有关成分的化学反应，此液可配成20 x、10 x 和 5 x 浓缩液的储存液（母液）。10 x 母液配制法 甲液：取450ml三蒸水依次溶解下列试剂 NaC1 80.0g KCl 4.0g MgSO4 7H2O 2.0g CaC12 1.4g(2H2O 1.85g)待完全溶解后，补足三蒸水至500ml。乙液：取 450ml三蒸水依次溶解下列试剂 Na2HPO4 0.6g（12H2O 1.52g）KH2PO4 0.6g 葡萄
6、糖 10.0g 0.4酚红 50.0mlw 2Hanks使用液配制法 取甲、乙液等量用三蒸水稀释10倍，即成使用液，用前高压灭菌。例如配制100 mlHank使用液，则取三蒸水900m l、甲液50ml、乙液50ml混匀，用110高压灭菌10min。临用时，用7.5NaHCO3调至所需pH。附：为配制上述Hanks液，应先配好0.4酚红溶液待用。w 2Hanks使用液配制法 取上述甲、乙液等量用三蒸水稀释10倍，即成使用液。用前高压灭菌。例如配制100 ml Hank使用液，则取三蒸水900ml 加入甲液50ml、乙液50ml混匀，用高压灭菌15min。临用时，用 7.5NaHCO3调至所需p
7、H。附：为配制上述Hanks液，应先配好0.4酚红溶液待用。配制方法如下：称取0.4g酚红，置玻璃研钵中细研，逐渐加入0.1mol/L NaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好加 NaOH的量，共加至 11.28ml为止，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.72ml，高压灭菌15min。n 第三节细胞培养常用试剂 细胞培养常用试剂主要包括分离组织和分散细胞用的细胞分离液（消化液）、调整培养液酸碱度的pH调整液、防止培养过程中发生污染的抗生素溶液、指示酸碱度（pH）的酚红溶液、检查细胞和观察研究细胞用的各种染液等。w 一、细胞分离液（消化液）常用的细胞分离液有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠（ED
8、TA）和胶原酶等，它们在制备原代细胞时可消化组织、分散细胞，在传代细胞时使细胞脱离生长表面（瓶壁）和使细胞团离散成单个细胞。它们可以单独使用，也可按一定比例混合使用，这主要取决于所培养细胞的要求。胰蛋白酶w 主要来自牛或猪的胰脏，淡黄色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。其活性是用水解酪蛋白的能力表示，常使用1：125和1：250，即1份胰酶分别能解离125份和250份酪蛋白,胰酶的离散作用与细胞的种类和特性密切相关。不同细胞系对胰酶溶液的作用浓度、温度和时间等的要求也不一样。浓度大、温度高、作用时间长对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度也会损伤细
9、胞、胰酶在pH80，温度37时，作用力最强。Ca+、Mg+血清、蛋白质的存在会降低其活力，可用无Ca+、M+的溶液配制，需要终止消化作用时，可加入一些血清或含血清的培养液或胰酶抑制剂来终止胰酶对细胞的继续作用。1和0.25胰蛋白酶溶液的配制w 将DHanks液用56 NaHCO3调至pH7.2左右。w 称胰酶粉末1克于烧杯中，选用少许平衡盐溶液调成糊状，再补足至100ml，搅拌均匀，置室温4小时或冰箱内过夜、并不时搅拌振荡。w 选用滤纸过滤，再用无菌玻璃滤器(G6）或蔡氏滤器（EKS2，EKS3）滤过除菌，按5ml（或1ml）分装小管，盖紧瓶盖，置低温冰箱保存备用。临用时将其用D-Hanks液
10、稀释成1:3（1份胰酶加3份D-Hanks），即得到0.25的胰蛋白酶溶液。胰酶溶液较酸，使用前再用56的NaHCO3调pH至7.2。乙二胺四乙酸钠（EDTA）胰酶一 EDTA消化液 pH调整液w 为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时都不预先加入NaHCO3，而在使用前再加入。故NaHCO3都是单独配制，高压灭菌。此外，为了维持培养液恒定的pH，以利于细胞的生长和增殖，还可利用HEPES强缓冲液。合成培养基大都呈弱酸性，而细胞生长的最适pH为7.07.2，可忍耐的pH范围6.67.8。pH到7.6时，细胞虽有代谢但不再分裂增殖，故使用培养基时要调整pH，并注意培养过程中的pH变化以及
11、时换液。常用的pH调整液是NaHCO3、HEPES等。NaHCO3溶液w 常用的浓度有 7.4、5.6、3.7。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌，分装小瓶，盖紧瓶塞，于4或室温保存。有的实验室用高压灭菌，虽有部分NaHCO3被破坏，但操作简单方便。调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭菌的10醋酸溶液或通入CO2气体调节。HEPESw 为了较长时间恒定pH，可使用缓冲能力较强HEPES（N2oxyethylpiperazine N-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基派嗪-N-2-乙磺酸），使用的终浓度为1050mmol
12、/L，可以根据缓冲能力的要求而定。HEPES的分子式为：C8H18O4N2S，分子量为238。HEPES可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中，再过滤除菌。每1000ml培养液中加入2.38克HEPES，待溶后用l mol/L NaOH 调pH至7.07.2，滤过除菌后使用。此时HEPES的使用浓度为10 mmol/L。亦可配成 100 x 贮存液（l molL），使用前取 99ml培养液加入 lml贮存液，最终应用浓度仍为10mmolL。w l mol/L（100 x）HEPES贮存液配制方法：w 取23.8g HEPES溶于 100ml双蒸水中，用ll mol/L NaOH调pH至7.5一
13、8.0后，过滤除菌，分装小瓶（2ml瓶），4或-20保存。抗生素液w 在离散细胞或培养细胞过程中，试液中加入适量抗生素，可预防操作不慎而产生的污染。常用的有青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素、二性霉素等。常配成100 x 或200 x 于使用浓度的盐溶液内，分装小瓶，冷冻保存。使用前加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。配制w 以青霉素、链霉素为例，配制如下：青霉素（钠盐）100万u 链霉素（双氢）l.0g（100 000g）溶于无菌三蒸水100ml，每毫升含青霉素10 000u，链霉素10 000g;分装小瓶，20冰冻保存。w 使用：99ml培养液中加入青、链霉素混合液lml，最终浓度为青霉素
14、100uml，链霉素100gml。w 使用金霉素时须用预热37的三蒸水溶解呈清澈的琥珀色。制霉菌素几乎不溶于水，故配制成悬液。四、L-Glutamin溶液w 制备：w LGlutamin 6g（分子量14615）三蒸水 200ml（1）滤过除菌；（2）分装；（3）一20保存；（4）使用时每100ml培养液加 l ml。第四节常用培养液w 培养基可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基，主要来自动物体液或从组织分离提取制备的，其营养成分较高，但成分复杂，个体差异较大，来源也有一定的限制。合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具有一定的组成，是较理想的培养基。但对动物细胞来说，它
15、只能维持细胞的生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充天然培养基，即两者混合在一起使用，效果更好。合成培养基的出现，促进了组织培养的发展，避免了生物差异的影响，细胞生长健康透明，延长了体外存活的时间，价廉易制取。一、天然培养基w 天然培养基（natural media）包括：血清、组织提取液等。血清是细胞培养中最常使用的天然培养基。血清中含有许多能维持细胞生长增殖不可缺少的成分，如蛋白质、多肽、激素及各种氨基酸、葡萄糖、酮酸等营养成分。w 种类：分人血清和动物血清两大类。细胞培养中最常用的是动物血清，来自牛、马、兔等动物，其中牛血清比马血清用得更广泛。牛血清分为胎牛血清（fetal bovines
16、erum，FBS）和小牛血清（calf serum，CS）两种。FBS是经剖腹从母牛子宫中取出的胎牛中分离到的血清，价格贵；CS是从刚出生但尚未哺乳的小牛中分离到的血清。目前市售的牛血清质量不一，购买之前应通过细胞培养进行选择试验，观察细胞生长增殖与否。也可以用克隆形成率和细胞生长曲线作为指标加以鉴定，而且要选择经过支原体试验合格的牛血清。w 3 水 解 乳 蛋 白（l a c t a l b u m i n hydrolysate，LH）：是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物。使用时配制成05的溶液，按80-85乳白蛋白液+15-20的 CS或40乳白蛋白液+40合成培养基+15-20CS。配
17、制方法如下：（1）称取0.5g水解乳蛋白粉末于烧杯中，先用灭菌的Hanks液调成糊状，然后补加 Hanks液至 100ml，不断搅拌，使其充分溶解。置室温中 l-2h，并不时搅拌；（2）滤纸过滤于另瓶中，加盖后经115高压蒸气灭菌10min。于 4冰箱保存备用。二、合成培养基w 合成培养基（Synthetic media）是根据研究和了解细胞所需成分的基础上配制而成的，现已成为普遍应用的商品化的培养基。但合成培养基尚未成为十分完全的培养基，它只能维持细胞不死，而不能促进细胞增殖生长，使用时尚需添加天然培养基，主要是牛血清。目前常用的合成培养基主要是MEM、Eagle、RPMl-l640、199
18、培养液等。MEM 培养液w 常用的是MEM（Minimum Eagle Medium，低限量培养基），仅含12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素，成分简单，适合各种已建成细胞系的培养，同时宜于添加或减少某些成分，也特别适于特殊研究的细胞培养工作。在它的基础上改良的 DMEM（Dulbeccos Modified Eagle Medium，Dulbecco改良的 Eagle培养基）应用也十分广泛。DMEM增加了各成分的用量（双倍），葡萄糖用量可选择低糖（1000mgL）或高糖（4500mgL），对于生长速度较快，附着性较差的肿瘤细胞生长有利。特别应用在附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆
19、培养时，采用高糖的培养液效果较好。常用于杂交瘤技术中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。RPMl-l640w RPMl-l640 是一种常用的培养液，最初是针对淋巴细胞的培养而设计的，问世后发现能广泛适应许多种类的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，而且成分简单，和MEM一样应用十分广泛。w 配制方法199培养液w 是第一个合成培养基于1950年问世，它含69种成分，几乎包括了所有的氨基酸、维生素和一些核酸衍生物、生长激素、脂类，加上硝酸铁和生理盐溶液，此较为复杂的合成培养液仅能短时间维持各类细胞的生长，只有加了血清之后才能作为生长培养基。199成分复杂，最近已不大使用。三、生长液与维持液
20、w 血清含有多种促进细胞生长、贴附的活性物质。合成培养基中不加血清或低浓度（如 2）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长，这种培养基称为维持液。加入5的血清，对大多数细胞来说，能维持不死和缓慢生长。一般需加入1020血清，有利于细胞生长，称为生长液。添加血清，虽利于细胞生长，但不明成分也增多了，对分析实验结果增加了困难。人们正在探索不用血清的无血清培养基。w 附 RPMI1640生长液和维持液配法；生长液：RPMI-1640 87 小牛血清 10 谷氨酸胺（100 X）1 双抗（100 X）1 用5.6NaHCO3调pH至7.0-7.2。维持液：RPMI-1640 95 小牛血清 2 谷氨
21、酸胺（100 X）1 双抗（100 x）1 用56NaHCO3调pH至7.0-7.2。四、无血清培养基w 无血清培养基主要由基础培养液和附加成分两部分组成，前者大多数仍采用合成培养基作为基础溶液，常用的是F12和 D M E M 培 基，二 者 按 1:1 混 合 补 加 15mmol/L HEPES等；后者是根据不同细胞的要求，附加特异性生长因子、激素、细胞附着蛋白、金属离子转移蛋白、细胞结合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂和微量元素等。w 激素类：胰岛素 三碘甲状腺原氨酸 生长激素（G）氢化可的松 维生素A酸w 生长因子：上皮生长因子（EGF）成纤维生长因子（FGF）神经生长因子（NGF）w
22、 金属离子转运蛋白：转铁蛋白 （transferrin）w 微量元素：硒酸钠（Na2SeO3）w 酶抑制剂：大豆胰酶抑制剂 （soybeantrypsin inbibitor）抑蛋白酶肽（aprotinin）w 培养基质：纤维连结素（fibronecti）多聚赖氨酸（polylysine）胶原（collagen）w 细胞结合蛋白：牛血清白蛋白（BSA）w 脂肪酸：乙醇胺 油酸或亚油酸参考文献w 1徐新来培养用液，清洗与消毒组织培养技术（鄂征主编）北京：人民卫生出版社1990P5699w 2杜平实用实验病毒学北京：人民卫生出版社19859098w 3.RobertJ KBiochemical Methods Culture and virology55 64
