1、第1页，共134页。主要内容主要内容动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中致病菌的检验动物性食品中致病性病毒的检验动物性食品中致病性寄生虫的检验第2页，共134页。食源性疾病是世界各国面临的主要公共卫生问题之一，即便是在欧美发达国家，患食源性疾中的人群可高达30%。污染食物对人类健康构成威胁的主要因子包括化学性和生物性两大类，前者如兽药、农药和重金属，后者包括细菌、真菌及其毒素、病毒等。根据美国疾病预防与控制中心统计，在20世纪90年代由各种原因引起的食源性疾病中，细菌性占90%，化学性仅占3%。第3页，共134页。根据国家食源性疾病监测网部分资料的分析结果显示，我国食源性疾根据国家
2、食源性疾病监测网部分资料的分析结果显示，我国食源性疾病的高危食品依次为病的高危食品依次为肉类、粮食、海产品、水果蔬菜、鸡蛋、豆类、奶肉类、粮食、海产品、水果蔬菜、鸡蛋、豆类、奶。由动物。由动物或植物性食物污染所引起的疫病比例接近（约各占或植物性食物污染所引起的疫病比例接近（约各占30%30%），而其中因微生物污染），而其中因微生物污染引起的食源性疾病比例接近引起的食源性疾病比例接近40%40%，远高于化学性食物中毒（，远高于化学性食物中毒（20%20%）。）。综观国内外食源性疾综观国内外食源性疾病的发病情况，动物性食品中微生物污染是人类食源性疾病的主要问题。病的发病情况，动物性食品中微生物污染
3、是人类食源性疾病的主要问题。2014年2月19日,国家食品安全风险评估中心,牵头起草的食品中致病菌限量标准，将自2014年7月1日起实施。该标准对肉制品、水产制品、粮食制品、即食果蔬制品、饮料等11大类食品分别制定了沙门氏菌等5种致病菌的限量规定，可基本满足我国食品中致病菌的控制需求，适应我国食品安全的监管需要。第4页，共134页。动物性食品易被微生物污染的原因1 食品基质 水分、丰富的营养物质2 食品的酸性3 环境条件：温度、气体、湿度第5页，共134页。动物性食品中微生物污染的可能途径主要有：动物性食品中微生物污染的可能途径主要有：食品原料本身的污染；食品原料本身的污染；动物养殖环境中的微
4、生物对食品原料的污染；动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染；屠宰过程中的污染；屠宰过程中的污染；深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微生深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微生物污染；物污染；食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应环境中微生食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应环境中微生物的污染；物的污染；在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。第6页，共134页。食品微生物检测所涉及的类群食品微生物检测所涉及的类群第7页，共134页。微生物检测程序微生物检测程序 样品的采集样品的采集注意：注意：1 1
5、所用接触样品的用具经过所用接触样品的用具经过灭菌灭菌 2 2 取样要均匀、特殊样品要取样要均匀、特殊样品要控制温度控制温度 3 3 样品采好后要贴上标签样品采好后要贴上标签（注明：样品名称、来源、数（注明：样品名称、来源、数量、采样人、地点及时量、采样人、地点及时间）间）样品的微生物检验样品的微生物检验注意：注意：1 1 采好的样品送检不采好的样品送检不要超过要超过3 3小时小时2 2 检完的样品的存放时检完的样品的存放时间间 3 3 报告的填写报告的填写 第8页，共134页。微生物对食品的污染问题是我国乃至全世微生物对食品的污染问题是我国乃至全世界食品安全中最突出的问题，我国为此数次颁界食品
6、安全中最突出的问题，我国为此数次颁布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标准要求，准要求，菌落总数和大肠菌群菌落总数和大肠菌群是食品企业出厂是食品企业出厂时必检的微生物指标。时必检的微生物指标。第9页，共134页。菌落总数菌落总数是指一定培养条件下（如需氧状况、培养基成分、是指一定培养条件下（如需氧状况、培养基成分、PH、培养温度和时间等）每克（每毫升）食品样品中所生长出来的培养温度和时间等）每克（每毫升）食品样品中所生长出来的细菌菌落总数。细菌菌落总数。检测菌落总数，检测菌落总数，可以判定食品被细菌污染可以判定食品被细菌污染程度，反映出食品的新鲜程度和
7、卫生状况程度，反映出食品的新鲜程度和卫生状况。如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，食品品的卫生状况达不到基本的卫生要求，食品将加速腐败变质，失去食用价值。将加速腐败变质，失去食用价值。小型企业，原料控制，加工车间控制不严小型企业，原料控制，加工车间控制不严第一节第一节 动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验第10页，共134页。菌落总数的检验程序菌落总数的检验程序25g(ml)样品样品+225ml生理盐水生理盐水(1:10的稀释液的稀释液)作几个适当倍数的稀释液作几个适当倍数的稀释液(例
8、如例如1:100，1:1000)选择选择23个适宜稀释度个适宜稀释度各取各取1ml分别加入灭菌培养皿中分别加入灭菌培养皿中每个平皿中加适量（每个平皿中加适量（1520ml）营养琼脂营养琼脂菌落记数菌落记数第11页，共134页。第12页，共134页。注意事项：注意事项：1 1 操作要在无菌的状态下进行。操作要在无菌的状态下进行。2 2 操作时间越短越好。操作时间越短越好。3 3 样品不同选择的稀释倍数不同。样品不同选择的稀释倍数不同。4 4 培养基冷却温度不宜过高或过低。培养基冷却温度不宜过高或过低。第13页，共134页。大肠菌群系指一群能发酵乳大肠菌群系指一群能发酵乳糖、需氧和兼性厌氧的革兰糖
9、、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括肠氏阴性无芽孢杆菌，包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克雷伯杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属细菌。菌属细菌。检测大肠菌群，检测大肠菌群，可以判定食品被与粪便污染有关的细菌污染可以判定食品被与粪便污染有关的细菌污染的程度。的程度。如果某食品的大肠菌群超标，则可以推测其产品中存在着如果某食品的大肠菌群超标，则可以推测其产品中存在着肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物中毒或罹患流行病。肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物中毒或罹患流行病。第14页，共134页。第15页，共134页。第二节第二节 动物性食
10、品中致病性细菌的检验动物性食品中致病性细菌的检验沙门氏菌沙门氏菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌副溶血弧菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌溶血性链球菌溶血性链球菌产单核细胞李斯特菌产单核细胞李斯特菌肉毒梭菌肉毒梭菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌变形杆菌变形杆菌第16页，共134页。动物性食品中沙门氏菌的检验动物性食品中沙门氏菌的检验第17页，共134页。一、教学目的一、教学目的1 1、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。2 2、掌握食品中沙门氏菌的检验方法。、掌握食品中沙门氏菌的检验方
11、法。第18页，共134页。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位第19页，共134页。二、实验原理二、实验原理（一）沙门氏菌属简介（一）沙门氏菌属简介沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关
12、的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现发现20002000多个血清型，我国已发现血清型近多个血清型，我国已发现血清型近200200个。个。沙门氏菌在水中不易繁殖，但可生存沙门氏菌在水中不易繁殖，但可生存2-32-3周，周，冰箱中可生存冰箱中可生存3-43-4个个月月，在自然环境的粪便中可存活，在自然环境的粪便中可存活1-21-2个月。沙门氏菌最适繁殖个月。沙门氏菌最适繁殖温度为温度为3737，在，在2020以上即能大量繁殖，因此，以上即能大量繁殖，因此，低温储存低温储存食食品是一项重要预防措施。品是一项
13、重要预防措施。第20页，共134页。沙门氏菌属沙门氏菌属生物学特性生物学特性形态特征：形态特征：革兰氏阴性，大小为革兰氏阴性，大小为1-31-30.4-0.4-0.9m0.9m的两端钝圆的短杆菌，无的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。运动力强。第21页，共134页。培养特性：培养特性：沙门氏菌沙门氏菌需氧或兼性厌氧需氧或兼性厌氧，10104242都可生长，最适生长温度为都可生长，最适生长温度为3737，最适，最适pHpH为为6.86.87.87.8。营养琼脂平板上：营养琼脂平
14、板上：35353737培养培养18-24h18-24h，其菌落大小一般为，其菌落大小一般为2 23mm3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。血平板上：中等大小的灰白色菌落。血平板上：中等大小的灰白色菌落。第22页，共134页。沙门氏菌属沙门氏菌属致病性致病性 沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，潜伏期一般沙门氏菌胃肠炎是由除伤寒沙门氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，潜伏期一般6-726-72小小时，主要症状为时，主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻、发热寒颤头痛。病程一般。病程一般1 12 2天或
15、更天或更长。感染剂量为长。感染剂量为15152020个菌，死亡率达个菌，死亡率达1 14%4%。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。长老人、免疫缺陷者等。污染源主要是污染源主要是人和家畜的粪便人和家畜的粪便，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在，沙门氏菌常存在于动物中，特别是禽类和猪。在许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动许多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的表面和动物粪便中已发现该类细菌。它们可以物粪便中已发现该类细菌。它们可以存在于多类食品存在于多类食品中，包括生肉，禽，奶制品中，包
16、括生肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶和蛋，鱼，虾和田鸡腿，酵母，椰子，酱油和沙拉调料，蛋糕粉，奶油夹心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。第23页，共134页。传播途径传播途径肉的污染肉的污染肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20%25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%，国内肉类沙门氏菌检出率在1.1%39.5%。蛋的污染蛋的污染中国蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9%-43.7%，由于吃蛋引起鼠伤寒病的病例报告逐渐有增加的趋势。环境污染环境污染食品在加工、运输
17、、出售过程中往往被沙门氏菌污染。沙门氏菌在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至2年之久。第24页，共134页。2013年年6月月10日，广东东莞某工厂爆发大规模的员工食物中毒事件，日，广东东莞某工厂爆发大规模的员工食物中毒事件，100多名员工出现多名员工出现发冷、高热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不适症状；发冷、高热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不适症状；13日，四川眉山市一所学校日，四川眉山市一所学校386人陆续出现发烧、腹泻、呕吐症状入院救治；人陆续出现发烧、腹泻、呕吐症状入院救治；15日，广州经济技术开发区一家包装厂日，广州经济技术开发区一家包装厂76名夜班工人纷纷出现上吐下泻和发烧症状。名夜班
18、工人纷纷出现上吐下泻和发烧症状。实验证明，沙门氏菌中毒的原因大多是因为食前未加热处理或加热不彻底。其实，沙门氏实验证明，沙门氏菌中毒的原因大多是因为食前未加热处理或加热不彻底。其实，沙门氏菌属在菌属在100时立即死亡，时立即死亡，70经经5分种，分种，65经经1520分钟，分钟，60经经1小时可被杀死。小时可被杀死。2011-08-05，美国最大的肉类加工巨头嘉吉公司，美国最大的肉类加工巨头嘉吉公司3日晚召回日晚召回3600万磅，即大约万磅，即大约1.63万吨火鸡肉。万吨火鸡肉。这为美国史上最大规模的召回事件。目前，美国这为美国史上最大规模的召回事件。目前，美国26个州已有个州已有77人感染沙
19、门氏菌，其中一人死亡人感染沙门氏菌，其中一人死亡。不过，美国多名政府官员介绍，即使确认火鸡肉受沙门氏菌污染，只要烹饪达到不过，美国多名政府官员介绍，即使确认火鸡肉受沙门氏菌污染，只要烹饪达到74摄氏度，仍可放摄氏度，仍可放心食用。心食用。第25页，共134页。（二）检验（二）检验 GB/T 4789.4-2003GB/T 4789.4-20031.1.前增菌前增菌:第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中(缓冲蛋白胨水）增菌，使缓冲蛋白胨水）增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。2.2.选择性
20、增菌选择性增菌:在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。3.3.选择性平板分离选择性平板分离:这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。4.4.生物化学筛选生物化学筛选:排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。排除大多数非沙门氏菌。也提供
21、了沙门氏菌培养物菌属的初步鉴定。5.5.血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。血清学技术提供了培养物菌种的鉴定。第26页，共134页。三、实验仪器和材料三、实验仪器和材料1 1冰箱：冰箱：0044。2 2恒温培养箱：恒温培养箱：363611，4242。3 3显微镜：显微镜：1010100100。4 4高压灭菌器。高压灭菌器。5 5 超净工作台。超净工作台。6 6 均质器或灭菌乳钵。均质器或灭菌乳钵。7 7 架盘药物天平：架盘药物天平：0g0g500g,500g,精确度精确度0.5g0.5g。8 8 灭菌广口瓶：灭菌广口瓶：500mL500mL。9 9 灭菌锥形瓶：灭菌锥形瓶：500mL500mL、
22、250mL250mL。10 10 灭菌吸管：灭菌吸管：10mL10mL（具（具0.1 mL0.1 mL刻度）。刻度）。11 11 天菌培养皿：天菌培养皿：90mm90mm。12 12 灭菌小试管：内径灭菌小试管：内径3mm3mm50mm50mm。13 13 灭菌毛细管。灭菌毛细管。第27页，共134页。四、培养基和试剂四、培养基和试剂1 1缓冲蛋白胨水缓冲蛋白胨水(BP)(BP)2 2氯化镁孔雀绿氯化镁孔雀绿(MM)(MM)增菌液增菌液3 3四硫酸钠煌绿四硫酸钠煌绿(TTB)(TTB)增菌液增菌液4 4亚硒酸盐胱氨酸亚硒酸盐胱氨酸(SC)(SC)增菌液增菌液5 5亚硫酸铋琼脂亚硫酸铋琼脂(BS
23、)(BS)6 6DHLDHL琼脂琼脂7 7HEHE琼脂：按琼脂：按GB/T 4789.28GB/T 4789.2820032003中中4.214.21规定。规定。8 8TSITSI琼脂琼脂9 9蛋白胨水、靛基质试剂蛋白胨水、靛基质试剂10 10 尿素琼脂尿素琼脂(pH7.2)(pH7.2)11 11 氨基酸脱羧酶试验培养基氨基酸脱羧酶试验培养基12 12 沙门氏菌因子血清：按沙门氏菌因子血清：按2626种用于初步分型；种用于初步分型；5757种用于进一步分型；种用于进一步分型；163163种种用于详细分型。用于详细分型。第28页，共134页。五、检验样品五、检验样品1 1 鲜猪肉、鲜牛肉；冻猪
24、肉鲜猪肉、鲜牛肉；冻猪肉2 2 鲜牛奶、鲜鱼；冻鱼鲜牛奶、鲜鱼；冻鱼3 3 香肠、虾仁香肠、虾仁第29页，共134页。六、沙门氏菌检验流程六、沙门氏菌检验流程 检样检样 前增菌法前增菌法 直接增菌法直接增菌法 冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品 鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳及其它未经加工的食品 25g 25g BP 225mLBP 225mL 25g 25g 灭菌生理盐水灭菌生理盐水25mL 25mL 制成检样均质液制成检样均质液 （36361 1）一般一般 4 h4 h，干蛋品，干蛋品 181824 h24 h10mL10mLMM(MM(或或
25、TTB)100mLTTB)100mL 10mL10mLSC 100mLSC 100mL 检样均质液的半量检样均质液的半量MM(MM(或或TTB)100mLTTB)100mL 检样均质液的半量检样均质液的半量SC 100mL SC 100mL 42 18 42 1824 h 24 h （36361 1）181824 h 42 1824 h 42 1824 h 24 h （36361 1）181824 h24 h BS BS DHL(DHL(或或HEHE、WSWS、SS)SS)（36361 1）404048 h 48 h （36361 1）181824 h 24 h 挑取可疑菌落挑取可疑菌落 TS
26、ITSI（斜面、底层、产气、（斜面、底层、产气、H H2 2S S）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（）、蛋白胨水（靛基质）、尿素（pH7.2pH7.2）、）、KCNKCN、赖氨酸、赖氨酸 H H2 2S S靛基质靛基质 H H2 2S S靛基质靛基质 H H2 2S S靛基质靛基质 非如左述的非如左述的 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸 尿素尿素KCNKCN赖氨酸赖氨酸/各种反应结果各种反应结果 甘露醇、山梨醇甘露醇、山梨醇 ONPGONPG 沙门氏菌血清学实验沙门氏菌血清学实验 沙门氏菌血清学实验沙门氏菌血清学实验 非沙门氏菌非沙门氏菌 非沙门氏菌非沙门氏菌 报
27、告报告第30页，共134页。七、操作步骤七、操作步骤 1 1、前增菌和增菌、前增菌和增菌 冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取均应经过前增菌。以无菌操作取25g25g（mLmL），），加在装有加在装有225mL225mL缓冲蛋白胨水的缓冲蛋白胨水的500mL500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以广口瓶内。固体食品可先应用均质器以80008000 10000r/min10000r/min打碎打碎1min1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于乳化，于36361
28、1培养培养4h(4h(干蛋品培养干蛋品培养18h18h24h)24h)，移取，移取10mL10mL，转种于，转种于100mL100mL氯化氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于4242培养培养18h18h 24h24h。同时，另取。同时，另取10mL10mL，转种于转种于100mL100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于363611培养培养18h18h24h24h。第31页，共134页。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取不必经过前增菌。各取25g(25mL)25g(25
29、mL)加入灭菌生理盐水加入灭菌生理盐水25mL25mL，按前法做成检样匀液；取，按前法做成检样匀液；取25mL25mL，接种于，接种于100mL100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于菌液内，于4242培养培养24h24h；另取；另取25mL25mL接种于接种于100mL100mL亚硒酸盐胱氨酸亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于增菌液内，于363611培养培养18h18h24h24h。第32页，共134页。2 2、分离、分离 取增菌液取增菌液1 1环，划线接种于一个亚硫酸铋环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个琼脂平板和一个DHLDHL琼脂平板琼脂
30、平板(或或HEHE琼脂平板、琼脂平板、WSWS或或SSSS琼脂平板琼脂平板)。两种增菌液可同时划线接。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于种在同一个平板上。于363611分别培养分别培养18h18h24h(DHL24h(DHL、HEHE、WSWS、SS)SS)或或40h40h48h(BS)48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落。观察各个平板上生长的菌落。第33页，共134页。沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板选择性琼脂平板沙门氏菌沙门氏菌、沙门氏菌沙门氏菌（即亚利桑那菌）（即亚利桑那菌）BS BS琼脂琼脂产硫化氢
31、菌落为黑色带有金属光泽，棕产硫化氢菌落为黑色带有金属光泽，棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成或棕色；有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变灰绿色的菌落，周围培养基不变黑色带有金属光泽黑色带有金属光泽 DHL DHL琼脂琼脂无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色无色半透明，产硫化氢菌落中心带黑色或几乎全黑色或几乎全黑色乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属属、相同；乳相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心带糖阳性的菌株为粉红色，中心带黑色黑色 HE HE琼脂琼脂 WSWS琼脂琼脂蓝绿色或蓝色；多数菌
32、株产硫化氢，菌蓝绿色或蓝色；多数菌株产硫化氢，菌落中心黑色或几乎全黑色落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色，中心黑色或几乎全黑色中心黑色或几乎全黑色 SS SS琼脂琼脂无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落无色半透明，产硫化氢菌株，有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显中心带黑色，但不如以上培养基明显乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与亚属属、相同；乳相同；乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色，但中心无黑
33、色形成时与大肠色，但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别埃希氏菌不能区别第34页，共134页。3 3、生化试验、生化试验 自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂、蛋白陈水铁琼脂、蛋白陈水(供做靛基质试验供做靛基质试验)、尿素琼脂、尿素琼脂(pH7.2)(pH7.2)、氰化钾、氰化钾(KCN)(KCN)培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各培养基和赖氨酸脱竣酶试验培养基及对照培养基各1 1管，于管，于363611培养培养18h18h24h24h，必要时可延长至，必要时可延长至48h48h，按生化反应初步鉴定，按生化反
34、应初步鉴定表判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于表判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1A1、A2A2和和B1B1，其他其他5 5种反应结果均可以排除。种反应结果均可以排除。第35页，共134页。肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 斜面斜面底层底层产气产气硫化氢硫化氢可能的菌属和种可能的菌属和种/沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸沙门氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德杆菌、变形杆菌属、缓慢爱德华氏菌华氏菌/沙门氏菌沙门氏菌、弗劳地氏柠檬酸、弗劳地氏柠檬酸杆菌、普通变形杆菌杆菌、普通变形杆菌沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、沙门氏菌属
35、、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属普罗菲登斯菌属伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、志贺氏菌属、大肠埃希氏菌、蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，蜂窝哈夫尼亚菌、摩根氏菌，普罗菲登斯菌属普罗菲登斯菌属/大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克大肠埃希氏菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏柠檬酸杆菌劳地氏柠檬酸杆菌注：阳性；阴性；注：阳性；阴性；/多数阳性，少数阴性多数阳性，少数阴性第36页，共134页。肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反应序号反应序号硫化氢硫化氢
36、（H H2 2S S）靛基质靛基质pH7.2pH7.2尿素尿素氰化钾氰化钾（KCNKCN）赖氨酸脱羧酶赖氨酸脱羧酶判定结果判定结果A1A1沙门氏菌属沙门氏菌属A2A2沙门氏菌属（少见）缓慢爱沙门氏菌属（少见）缓慢爱德华氏菌德华氏菌A3A3弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异弗劳地氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌变形杆菌A4A4普通变形杆菌普通变形杆菌B1B1沙门氏菌属、大肠埃希氏沙门氏菌属、大肠埃希氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌菌、甲型副伤寒沙门氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B2B2大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌、志贺氏菌属大肠埃希氏菌、志贺氏菌属B3B3/克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆克雷伯氏
37、菌族各属阴沟肠杆菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌菌、弗劳地氏柠檬酸杆菌B4B4/摩根氏菌，普罗菲登斯菌属摩根氏菌，普罗菲登斯菌属注注1 1：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。：三糖铁琼脂底层均产酸，不产气者可排除；斜面产酸与产气与否均不限。注注2 2：KCNKCN和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。和赖氨酸可选作其中一项，但不能判定结果时，仍需补做另一项。注注3 3：表示阳性；表示阴性；：表示阳性；表示阴性；/表示多数阳性，少数阴性。表示多数阳性，少数阴性。第37页，共134页。沙门氏菌检验沙门氏菌检验几点注意几点注意冷冻样品解冻需在冷冻样品解冻需在4
38、545以以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min15min或或在在2-82-8，1818小时内软化。小时内软化。为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。数量的菌落进行生化和血清学鉴定。进行生化反应时，应以进行生化反应时，应以纯培养物纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。测试
39、中应同时接种阳性对照菌株。测试中应同时接种阳性对照菌株。第38页，共134页。金黄色葡萄球菌细菌学及其检验 第39页，共134页。v 自然分布自然分布：金黄色葡萄球菌分布广金黄色葡萄球菌分布广泛，存在于环境、空气、水、牛奶、泛，存在于环境、空气、水、牛奶、食品、污水及人和动物等。与人关系食品、污水及人和动物等。与人关系密切，构成人体皮肤、鼻腔、咽部等密切，构成人体皮肤、鼻腔、咽部等处的正常细菌群，对人有致病性，是处的正常细菌群，对人有致病性，是临床医学中常见的化脓性球菌之一，临床医学中常见的化脓性球菌之一，也是污染食品造成食物中毒的细菌之也是污染食品造成食物中毒的细菌之一。一。1 1 生物学性
40、状生物学性状 第40页，共134页。形态与染色：形态与染色：典型金黄色葡萄球菌呈典型金黄色葡萄球菌呈球形球形，直径，直径0.51.0微米，较非致病性葡萄微米，较非致病性葡萄球菌略小，各个菌体的大小及排列较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，球菌略小，各个菌体的大小及排列较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂，堆积成葡萄串状排列。在脓汁或液体培养基中生长，常呈双球或短链排列，易误堆积成葡萄串状排列。在脓汁或液体培养基中生长，常呈双球或短链排列，易误为链球菌。金黄色葡萄球菌无鞭毛，故不能自由移动，一般不形成荚膜，不产生为链球菌。金黄色葡萄球菌无鞭毛，故不能自由移动，一般不形成荚膜，不产生芽孢
41、。革兰氏染色为阳性，衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，常转呈革兰氏阴芽孢。革兰氏染色为阳性，衰老、死亡或被白细胞吞噬的菌体，常转呈革兰氏阴性，故须注意。性，故须注意。第41页，共134页。培养特性：培养特性：本菌为需氧或兼性厌氧，对营养要求不高，在普通本菌为需氧或兼性厌氧，对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，最适宜生长温度为培养基上生长良好，最适宜生长温度为37，最适宜，最适宜pH为为7.4，耐盐性强，在含耐盐性强，在含10-15%氯化钠培养基中能生长，利用这一特性，可氯化钠培养基中能生长，利用这一特性，可有利于金葡菌的检出。有利于金葡菌的检出。第42页，共134页。在普通琼脂培养基上形成圆
42、形、凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明在普通琼脂培养基上形成圆形、凸起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明的菌落。直径一般为的菌落。直径一般为1-2mm，密集生长的菌落较小，稀散或生长较久着，密集生长的菌落较小，稀散或生长较久着，直径直径可达可达4-5mm。在普通肉汤培养基中生长迅速，一般呈均匀混浊生长，如培养基中的糖类被在普通肉汤培养基中生长迅速，一般呈均匀混浊生长，如培养基中的糖类被分解后，产生较多的酸性物质即可发生酸性沉淀。培养时间较长，分解后，产生较多的酸性物质即可发生酸性沉淀。培养时间较长，2-3日后常有日后常有菌膜形成而出现粘性沉淀菌膜形成而出现粘性沉淀第43页，共134页。在血
43、琼脂平板上形成较大菌落，有色素在血琼脂平板上形成较大菌落，有色素产生，由于本菌产生的色素为脂溶性不产生，由于本菌产生的色素为脂溶性不溶于水，故色素只局限于菌落内，不透溶于水，故色素只局限于菌落内，不透入培养基中。该菌产生溶血毒素，使菌入培养基中。该菌产生溶血毒素，使菌落周围红细胞溶解而形成透明的溶血环，落周围红细胞溶解而形成透明的溶血环，非致病性葡萄球菌无此现象。非致病性葡萄球菌无此现象。第44页，共134页。在在Bairdparker琼脂平板上，菌落呈圆形凸起，表面光滑琼脂平板上，菌落呈圆形凸起，表面光滑湿润，直径湿润，直径23mm，灰黑色至黑色灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色，有光泽，常有浅
44、色的边缘，周围绕以的边缘，周围绕以不透明圈不透明圈，其外常有一清晰带，菌落有，其外常有一清晰带，菌落有黄油样粘稠感。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌黄油样粘稠感。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。较干燥。第45页，共134页。抵抗力：抵抗力：葡萄球菌抵抗力较强，在干燥的脓葡萄球菌抵抗力较强，在干燥的脓汁中能存活数月，有些菌株需加热汁中能存活数月，有些菌株需加热80 3060分钟才被杀死。在分钟才被杀死。在5%石炭酸中石炭酸中15分分钟死亡。钟死亡。第46页，共134页。2 2 致病
45、性致病性金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌为潜在性的病原菌潜在性的病原菌，它所产生的多种，它所产生的多种胞外蛋白胞外蛋白质质对人和动物组织有害，其中一类是各种酶对人和动物组织有害，其中一类是各种酶类类，如脂酶、蛋白，如脂酶、蛋白酶、青霉素酶、凝固酶和耐热酶、青霉素酶、凝固酶和耐热DNA酶等，另一类为酶等，另一类为毒素毒素，它，它们是溶血素（们是溶血素（、）、溶白细胞素、肠毒素（）、溶白细胞素、肠毒素（A、B、C、D、E、TSS）及化脓性毒素等。）及化脓性毒素等。第47页，共134页。2 2 致病性致病性 虽然人体对金葡菌感染具有一定的抵抗力，但当机体抵抗力下降或虽然人体对金葡菌感染具有一定的抵抗力
46、，但当机体抵抗力下降或皮肤粘膜受损时易被感染，可引起局部或全身炎症，侵入血流可引皮肤粘膜受损时易被感染，可引起局部或全身炎症，侵入血流可引起败血症及脓毒血症。金葡菌污染食品之后可能产生起败血症及脓毒血症。金葡菌污染食品之后可能产生大量的肠毒大量的肠毒素，肠毒素是该菌引起食物中毒的主要因素之一。素，肠毒素是该菌引起食物中毒的主要因素之一。第48页，共134页。金葡菌肠毒素具有极强的稳定性，能抵抗许多蛋白酶的消化，金葡菌肠毒素具有极强的稳定性，能抵抗许多蛋白酶的消化，只有在只有在小于小于pH2pH2的条件下蛋白酶才能使其失去活性。这一点可以解释，的条件下蛋白酶才能使其失去活性。这一点可以解释，为什
47、么摄入肠毒素在胃中有蛋白酶时，仍然引起食物中毒，因为胃液为什么摄入肠毒素在胃中有蛋白酶时，仍然引起食物中毒，因为胃液的酸度大于的酸度大于pH2pH2，所以不能消化肠毒素。肠毒素还相当耐热，经煮沸，所以不能消化肠毒素。肠毒素还相当耐热，经煮沸3030分钟后仍不能完全破坏其毒性。当含肠毒素为分钟后仍不能完全破坏其毒性。当含肠毒素为20/ml 20/ml 的的牛肉汤（牛肉汤（pH6.2pH6.2），在），在121 121 加热需要加热需要3737分钟以上，才能灭活毒素。分钟以上，才能灭活毒素。第49页，共134页。金葡菌肠毒素的产生因菌株不同而有所差异，有资料显示，食品中存金葡菌肠毒素的产生因菌株不
48、同而有所差异，有资料显示，食品中存在的金葡菌几乎都产生肠毒素。以往认为凝固酶阳性的金葡菌能产生在的金葡菌几乎都产生肠毒素。以往认为凝固酶阳性的金葡菌能产生肠毒素，但不是都产生肠毒素。后有实验证实，有些产生肠毒素的金肠毒素，但不是都产生肠毒素。后有实验证实，有些产生肠毒素的金葡菌株产生耐热葡菌株产生耐热DNADNA酶却不产生凝固酶，即一些凝固酶阴性菌株也产生酶却不产生凝固酶，即一些凝固酶阴性菌株也产生肠毒素，要鉴定是否是产毒株，需同时进行凝固酶和耐热肠毒素，要鉴定是否是产毒株，需同时进行凝固酶和耐热DNADNA酶测定试验。酶测定试验。而耐热而耐热DNADNA酶和肠毒素的耐热力相近似，由此可见耐热
49、酶和肠毒素的耐热力相近似，由此可见耐热DNADNA酶的产生与肠酶的产生与肠毒素的关系较凝固酶更为平行。所以常用耐热毒素的关系较凝固酶更为平行。所以常用耐热DNA DNA 酶试验代替肠毒素测酶试验代替肠毒素测定。自定。自19821982年起有些国家就提出进口方便食品中不得检出含有耐热年起有些国家就提出进口方便食品中不得检出含有耐热DNADNA酶酶的金葡菌。的金葡菌。第50页，共134页。“金球菌金球菌”列为列为“极重要质量项目极重要质量项目”2011年11月，“思念”、“三全”和“湾仔码头”等国内速冻食品知名品牌相继被检出金黄色葡萄球菌超标后，使得速冻食品行业陷入“细菌门”。卫生部于2012年1
50、2月21日实施的速冻面米制品食品安全国家标准，将金黄色葡萄球菌检测由定性转向定量，规定每批产品抽检5个样品中，至多只能有1个样品每克生制品中检出的金黄色葡萄球菌含量在1000至10000个之间第51页，共134页。结核分枝杆菌第52页，共134页。分枝杆菌属分枝杆菌属MycobacteriumMycobacterium一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸），状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸），耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。不产生毒
