1、基因治疗与反义药物基因治疗与反义药物 陈华 陈俊吉 王亦枫 肖阳 方友第一节第一节 基因治疗概论基因治疗概论 一、基因治疗的概念 凡是将新的遗传物质转移得到某一个体的细胞内，使功能正常的但表达量很低的基因、机体本身不存在的外源基因得到正常表达，或者降低、抑制机体基因的表达，从而达到治疗的目的，这种治疗方法就称为基因治疗 基因治疗的对象是人体，因此基因治疗要求确保有效和安全，其难度远远高于在表达系统中表达的基因工程技术近些年来，基因治疗取得了重大进展，研究内容也已经从单基因的遗传病扩大到多基因的肿瘤、艾滋病、心血管和神经系统等方面疾病 二、基因治疗的方法 1.基因增补 基因增补就是将正常的基因导
2、入病变细胞或其他细胞，以补偿缺陷基因的功能或调整细胞的某些功能基因增补是目前最常用的基因治疗方式 2.基因替换用同源重组或者基因打靶技术，用正常基因替换整个致病基因，使致病基因得到永久更正这种以正常基因替换致病基因的方法是最为理想的基因治疗，但是目前技术手段，体内重组的频率还太低，只有百万分之一左右 3.基因修复 是指将致病基因的突变碱基在原位进行纠正，而正常的部分予以保留这种方法是最理想的基因治疗方法，但是目前还没有成功的报道，只是一种理论上的理想的方式4.基因修饰 基因修饰是指将目的基因导入病变细胞或者其他细胞，目的基因的表达产物特异性的修饰突变缺陷细胞的功能或者使原有的功能得到加强，但致
3、病基因本身并没有改变与基因替换和基因修复相比，这种方法比较容易实现，也是基因治疗最常用的方法之一5.基因失活 利用反义技术将反义寡聚核苷酸或反义RNA导入细胞，特异性地封闭某些基因的表达，以达到抑制有害靶基因的表达作用，也就是人们通常意义上所说的反义疗法 引入的反义物质，可以通过和基因组DNA结合，降低或阻止转录的发生，也可以通过和mRNA的结合，阻止或降低蛋白质的翻译，还可以通过核酶降解mRNA 许多肿瘤的发生都涉及多重癌基因及相关基因的激活并过度表达，抑制这些基因的表达导致肿瘤细胞发生逆转6.免疫基因的治疗 将抗体、抗原、细胞因子的基因导入患者的体内，改变免疫状态，以达到预防和治疗疾病的目
4、的 将抗原基因导入机体内，可以理解为是一种DNA疫苗，特别是治疗性的核酸疫苗 7.自杀基因治疗 这是一种肿瘤的治疗方法，是指向肿瘤细胞中导入一种基因，基因产物为一种酶，它可以将无细胞毒性的药物前体转化为毒性代谢产物，将肿瘤细胞杀死，又称为活化前体药物基因治疗，这种基因也就被称为“自杀基因”8.耐药基因治疗 耐药基因的治疗是指为了提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力，将产生抗毒性的基因导入人体细胞如向骨髓干细胞中导入多药抗性基因mdr-1，使机体耐受更大剂量的化疗 三、基因治疗的途径 ex vivoin vivo 1.ex vivo 是指将含外源基因的载体外导入到人体自身或异体细胞（异种细胞），经体外
5、细胞扩增后，输回人体 这种方法简单，溶液操作，而且外源物质能被稀释并清除。但是载体系统不易形成规模，而且需要专门的临床基地 2.in vivo 将外源基因装配与特定的真核表达载体，直接导入体内 载体可以是病毒型的或者非病毒型的，甚至可以是裸露的DNA 这种方式比较容易大规模生产。但是必须保证载体的安全性，而且进入人体后，能导入靶细胞并稳定表达达到治疗目的 第二节第二节 基因治疗的原则和问题基因治疗的原则和问题 一、基因治疗的原则 基因治疗的步骤 分离出具有特定功能的特异性基因获得足够量该基因的载体或细胞建立有效的途径将外源基因导入机体内 进入宿主细胞的外源基因必须产生足够量的产物，维持适当的时
6、间，且不产生有害的副作用 1.选择目的基因的原则 待研究基因的异常是发生疾病的根源该基因遗传的分子机制已经研究清楚基因已经被克隆，且表达机制研究得较为清楚转移的基因最好能够完整、稳定地整合到受体细胞的基因组上，并且适量表达功能蛋白有合适的启动子控制、完整的信号肽等 2.受体细胞选择的原则 最好选择组织特异性细胞，以便使外源基因只在该特异性组织细胞中表达，而在其他组织中不表达或表达水平很低细胞易于从体内取出，有增值趋势，且生命周期较长离体的细胞能接受外源基因的转染细胞经过体外操作能够存活下来，并能安全输送回体内3.载体的选择 作为一种基因载体，易于导入到受体细胞调控基因复制、表达等元件，在宿主细
7、胞中能适量表 二、基因治疗中的问题 安全性 高效的靶向性基因导入 外源基因表达的可控性 治疗基因过少 第三节第三节 基因治疗的病毒载体基因治疗的病毒载体 用于基因治疗的病毒载体系统应该具备条件 携带外源基因并能包装成病毒颗粒介导外源基因的转移和表达对机体不致病 一、逆转录病毒载体 转录病毒是一类正链RNA病毒，可以逆转录成DNA，以前病毒形式存在，前病毒还可以整合到基因组上，和宿主细胞长期共存二、腺病毒载体 腺病毒是双链DNA病毒腺病毒通过大量复制DNA和蛋白质，并包装成病毒颗粒，严重地阻碍宿主细胞的DNA和蛋白质的合成，使细胞营养枯竭而死亡腺病毒主要感染上皮细胞，产毒性感染主要发生在肠胃道、
8、呼吸道和眼部上皮细胞三、腺相关病毒载体 腺相关病毒是单链线状DNA病毒，最初在腺病毒液中发现腺病毒必须在外界刺激因子作用下发生复制性感染，一般情况下以潜伏状态与宿主共存偏向于整合到人基因组19号染色体的长臂上 四、单纯疱疹病毒载体 单纯疱状病毒是双链DNA病毒 第四节第四节 基因治疗的非病毒载基因治疗的非病毒载体体 一、脂质体 阳离子脂质体 阴离子脂质体 pH敏感型脂质体 融合脂质体 二、阳离子多聚物 利用DNA的电负性，可以和电正性的氨基基团相互作用，形成稳定的多聚物，使DNA不易被核酸酶降解，并可防止大的复合物在短时间内沉淀，从而提高转染效率 三、质粒DNA 质粒DNA就是在体外将目的基因
9、及其所有的顺式调控元件质粒DNA的基因转移为非整合性，但是转染效率低，难以在细胞中长期表达质粒DNA可以采用三种方式注射到机体内：裸露DNA直接注射，目前在骨骼肌和心肌中表达最好；将DNA包裹在脂质体中注射；受体介导的基因转移，将DNA与配体相连，增加DNA的定向导入 四、其他非病毒载体 1.脂质DNA多聚物结合脂质体和阳离子多聚物的优点，将脂质体、DNA、多聚赖氨酸混合制备而成。2.生物高聚物DNA微球体和纳米粒生物高聚物如白明胶、壳聚糖等，可以包裹或结合DNA，形成微米级或纳米级的药物3.利用微生物或其他成分构建的载体如利用病毒外壳蛋白的运输能力，来介导基因的转移 第五节第五节 疾病的基因
10、治疗疾病的基因治疗 一、基因治疗与肿瘤 肿瘤的基因治疗，根据作用机制可以分成两类调节机体免疫利用正常细胞和肿瘤细胞的差异。1.导入细胞因子基因进行治疗 许多细胞因子，如干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等，都有提高人体免疫力，抑制肿瘤的作用 2.导入MHC的基因治疗 主要组织相容性复合体（MHC）是具有个体特性的抗原系统 肿瘤细胞免疫逃逸机制中一个重要方面，就是肿瘤细胞上的MHC表达很弱或者不表达，使机体免疫应答不能发生 3.导入抑癌基因的基因治疗 很多肿瘤细胞的某些基因异常表达，被称为癌基因，当他们处于正常状态时，就称为原癌基因机体正常细胞存在抑制细胞异常增殖的基因，即
11、抑癌基因，它们在细胞周期的调控和细胞凋亡中，起着非常重要的作用肿瘤细胞中，抑癌基因往往会产生突变、重排或缺失或者表达异常。4.自杀基因的治疗 自杀基因疗法的基本思想就是将编码某种特殊酶的基因导入细胞，使无毒的前体药物转变为有活性的毒物，引起靶细胞的死亡 5.肿瘤疫苗 从基因治疗的角度来看，肿瘤疫苗就是将肿瘤的组织特异性抗原的基因，导入到机体内，表达出的抗原，激发机体的免疫系统，对肿瘤细胞进行杀伤 二、基因治疗与艾滋病 艾滋病又称获得性免疫缺陷综合症，是由于人免疫缺陷病毒HIV感染，特异性地破坏了免疫细胞CD4，使机体发生免疫缺陷，造成机体发生肿瘤、机会性感染的一种致死性疾病HIV病毒是单链的R
12、NA逆转录病毒，其外壳糖蛋白Gp120可以和CD4特异性高亲和力结合，使CD4T细胞减少，并使细胞因子的分泌功能受阻，引起机体的免疫缺陷 1.反义核酸 用互补于mRNA的DNA或RNA，在细胞内形成双链分子，阻碍mRNA的剪接、运送、翻译，降低mRNA的稳定性，从而影响病毒基因的表达与复制。目前需要解决的问题是反义核酸的专一性转移和进入靶细胞之前的降解 2.核酶 核酶是具有催化RNA自我剪切反应的核酸，目前报道的核酶是在培养细胞上干预HIV基因的表达核酶的稳定性比较低，生理条件下反应缓慢是其用于抗HIV的不足之处，同时针对它在机体内是怎样被转录和转录后抗RnaseH的能力还需进一步研究 3.可
13、溶性CD4分子的表达 编码CD4的基因已经得到了克隆，并已经在真核系统中表达。将CD4分子的编码基因通过逆转录病毒载体导入到外周淋巴细胞、骨髓造血干细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞中得到表达，表达出来的CD4分子可以与入侵的HIV病毒包膜蛋白Gp120结合，竞争性地保护CD4T淋巴细胞不受或少受感染 4.特异性抗体的诱导 诱导机体产生抗HIV的特异性抗体也是抗HIV治疗的一个重要方法，将gp120的基因导入人体中表达，诱导抗包膜蛋白Gp120的体异性抗体，不仅可以诱导产生IgG，而且可以引发特异性的细胞免疫 5.Tat蛋白突变体表达Tat蛋白在HIV病毒基因的复制和转录过程中有着极为重要的反
14、式调控作用，将突变体形式的tat基因导入人体后，突变体的大量表达，竞争性地结合Tat受体位点，抑制或干扰HIV病毒基因组的正常复制和转录功能 第六节第六节 反义技术概论反义技术概论 一、反义技术与反义核酸 反义技术是指用人工合成或生物合成的核酸分子,抑制、封闭、破坏靶基因的技术。反义技术中的核酸分子可以是DNA，RNA或者肽核酸 反义技术中所用的核酸，一般又称为反义核酸，就是根据碱基互补配对原理，结合并调节靶基因活性的核酸分子 通过翻译技术制备的药物，就是人们常说的反义药物 二、反义核酸药物特点 1）高度特异性2）高效性3）最优化的药物设计 4）低毒、安全 5）制备简单 三、反义技术的分类1.
15、反义脱氧核苷酸（ODN）又称反义DNA，通过与mRNA的结合形成DNA-RNA杂合体，从而影响基因的表达调控。由于DNA序列合成仪的广泛使用，所以ODN很容易获得 2.反义RNA 反义RNA是与能mRNA序列互补配对形成双链复合物的RNA片段，影响基因的翻译 3.核酶 核酶存在于生物细胞中，是一类具有催化活性的RNA分子，具有核酸酶的水解活性，可以特异性地剪切RNA分子 4.三链形成寡核苷酸（TFO）三链形成寡聚核苷酸是指可与双链或单链DNA形成三股链，从而抑制基因转录的寡核苷酸 5.肽核酸（PNAS）肽核酸是以肽为骨架的DNA类似物，是用手性不对称的中性肽链骨架置换脱氧核糖磷酸而成第七节第七
16、节 反义技术原理和方法反义技术原理和方法一、反义脱氧核酸天然存在未经修饰的磷酸二酯脱氧化核苷酸（POODN）作为反义药物虽然有和靶RNA发生特异序列结合，激活Rnase H的活性，但是在生理条件下，PO-ODN对核酸酶很敏感，易被快速降解，限制了它的实际使用 1.第一代硫代寡聚核苷酸（PS-ODN）以一个硫原子取代了核酸中磷酸的非桥羟基上的氧原子 显著地提高了化合物在各种环境中对核酸酶的稳定性，而且保留了在交亲和性以及对RnaseH的激活活性 第一个获得美国FDA批准的反义药物弗米韦新 2.第二代混合骨架寡核苷酸（MBO）典型的MBO为三明治寡核苷酸 中间是PS-ODN片段，能够提供激活Rna
17、seH活性的信息 5端和3端为对核酸酶稳定的修饰寡核苷酸，主要是对核糖的2号位烷基化的PS-ODN 一个MBO分子通常由中间810个碱基的PS-ODN和两端的46个甲基化的PS-ODN组成 二、反义RNA 反义RNA可以通过人工合成，但是更容易被细胞内的核酸酶降解一般利用基因重组技术将靶基因序列反向插入到病毒载体或质粒载体的启动子和终止子之间，克隆后导入细胞内进行转录，从而源源不断地产生反义RNA 常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、HIV病毒载体非病毒载体常用的就是质粒载体。三、核酶 1990年Sarver首先报道核酶在体外培养的细胞中成功地抑制了HIV的复制，从而引
18、起了越来越多的医学和生物工作者的重视 天然存在的核酶根据催化活性分为下面几类1）锤头状核酶、发卡核酶和肝炎核酶。它们为小分子核酶，主要在病毒或类病毒RNA中发现，其特点是可以自我剪切特定的磷酸二酯键。2）I型内含子和II型内含子核酶。它们分子量较大，在低等生物和一些细菌的内含子中存在，可以进行自我剪接，被加工成反式作用的核酶3）RNaseP核酶。最早在大肠杆菌中发现，具有tRNA前体加工活性获得核酶的方法可以通过人工合成或表达载体的表达裸露的RNA在体液中的半衰期是以秒来计算的，所以局部注射或使用裸露RNA是不可能的必须通过修饰增加稳定性后才能直接使用用载体进行表达是比较好的选择，最常用的载体
19、是腺相关病毒载体 四、三链形成寡核苷酸 三链形成寡聚核苷酸是直接作用于DNA的转录或复制过程寡聚嘧啶或嘌呤的TFO，通过Hoogteen碱基配对规则，形成三链核苷酸，从而抑制基因的转录，转录因子或RNA聚合酶的结合位点是TFO常用的靶点 对于单链DNA或RNA，可以用两个寡聚核苷酸结合形成TFO，从而抑制单链DNA引物的延伸、单链RNA病毒的逆转录 五、肽核酸肽核酸是以肽链骨架代替核糖磷酸骨架的DNA类似物，其骨架为电中性。1991年丹麦科学家Nielsen等首先报道了肽核酸 两个肽核酸可以和单链DNA或RNA形成三螺旋结构 PNA-RNA不是RNaseH的水解底物，所以PNA的反义作用具自己不同的机制，如空间结构上阻断核糖体或重要的翻译因子 docin/sanshengshiyuandoc88/sanshenglu 更多精品资源请访问更多精品资源请访问
