1、基因治疗北京大学眼科中心 北京大学第三医院12目录目录第二部分第二部分 基因治疗载体选择基因治疗载体选择第一部分第一部分 基因治疗概述基因治疗概述 第三部分第三部分 基因治疗的发展历程基因治疗的发展历程第四部分第四部分 临床基因治疗临床基因治疗2一、基因治疗概述一、基因治疗概述v 1993年FDA定义： 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预v 包括以下两方面： 患者体内分离细胞，进行体外修饰，随后再注入患者体内 基因治疗产品直接注入患者体内，使细胞发生遗传学改变 3v黑色箭头所示：从患者体内分离细胞，在实验室中修饰后回输给患者（回体基因治疗）v灰色箭头所示：细胞在患者体内进行修饰（体内基因治
2、疗）4基因治疗特点基因治疗特点v 普通的医疗方法对绝大多数遗传病都束手无策，即使治疗也是治标不治本；基因治疗在基因水平上进行操作，能从源头上解决疾病的发生。目前在没有治疗方法或疗效不佳的领域基因治疗将大有作为v 基因治疗属新兴的治疗技术，技术更迭速度很快v 目前所有的基因治疗均为体细胞治疗，生殖细胞基因治疗会产生永久的可传递的修饰，由于伦理原因而被禁止5基因治疗方式基因治疗方式v 基因添加或替代：提供缺陷基因的一个有功能的拷贝v 基因沉默：沉默功能获得性突变v 基因编辑：特定靶点的定向修饰67基因治疗三因素基因治疗三因素v 确诊致病基因v 基因治疗载体构建：替代、沉默、编辑？v 合适的基因转移
3、载体8二、二、基因治疗载体基因治疗载体v 病毒载体：高效性 （最常用） 反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒等v 非病毒载体 脂质体、直接注射或微粒轰击、受体介导内吞等 没有一个基因转移体系是完美的，每一种都有它的优点和局限性9反转录病毒（反转录病毒（RV）v 含有反转录酶的RNA病毒，能够合成其基因组的一个cDNA拷贝。反转录病毒释放核蛋白复合体至受感染细胞的细胞质中，此复合体反转录病毒RNA基因组，并随后将产生的cDNA整合到宿主细胞一条染色体的单一随机位点。v 优点：能高效感染宿主细胞；整合入染色体随细胞分裂传代v 缺点：随机整合导致成瘤风险；转染分裂期细胞；8kb10v反转录病毒
4、含三个转录单位，还有一个顺式作用元件，在载体中，三个转录单位被治疗基因替代，最大克隆的容量是8kb。重组体在特定细胞中包装，该细胞可提供必需的三个转录单位，但不含完整的反转录病毒基因组。11腺病毒（腺病毒（AV）v 双链DNA病毒，线性双链DNA基因组在细胞核内作为附加体存在而不整合v 优点：能高效感染分裂期和非分裂期细胞；35kb；非整合减少插入突变v 缺点：表达时间短（2-4w），用于基因高水平的瞬时表达； 有免疫原性1213腺病毒相关病毒（腺病毒相关病毒（AAV）v 非致病性单链DNA病毒，依赖于腺病毒或疱疹辅助病毒共同感染后才能复制；未修饰的AAV在19q的特定位点整合至染色体DNA，
5、提供长效表达但无插入诱变风险v 优点：感染分裂期和非分裂期细胞；免疫反应小v 缺点：4.5kbv 单基因遗传病基因治疗领域广泛应用14v ITR为末端重复序列，也是病毒复制和包装唯一需要的顺式作用元件。在载体中，两个转录单位被治疗基因替代15慢病毒（慢病毒（LV）v 应用于非分裂细胞的反转录病毒，随机整合入宿主染色体，可供基因长效表达。人类免疫缺陷病毒（HIV）是大多数慢病毒载体的基础v 优点：多种非分裂细胞进行高效的转染和长期稳定表达v 缺点：随机整合成瘤风险v 慢病毒载体逐渐成为基因治疗领域的新生力量16v 首先将转移质粒、包装质粒和包膜蛋白质粒转染到293T细胞。更换新鲜的培养基后，继续
6、培养4872小时。收集培养液，进行离心浓缩后，就可得到转导细胞级别的病毒颗粒。17脂质体脂质体v 脂质体是当某一脂类混于水溶液时自发形成的人造囊泡。DNA在体外由脂质体包装并被转移，直接用于转移至靶细胞v 优点：容易制备，对转移DNA大小无限制v 缺点：转移效率低；导入DNA不整合入染色体，瞬时转染18v DNA被转运到带负电荷的脂质体的内部或结合到带正电荷的脂质体的表面v 当脂质体与细胞质膜融合时DNA转移就发生了v 阳离子脂质体是最常用的1920裸基因直接注射裸基因直接注射v DNA可以用注射器或针头直接注射到靶组织v 缺点：转染效率低v 1991年 裸基因注射治疗DMD动物实验，注射的D
7、NA可持续表达几个月v 可应用于疫苗，把致病微生物的蛋白质基因整合于质粒载体中，注射机体后会产生蛋白质作为免疫原，诱导机体免疫反应以治疗感染性疾病。21基因枪注射基因枪注射v DNA由金属颗粒包装后由特殊的枪发射到细胞中v 优点：简单、安全v 缺点：转染效率低22三、基因治疗的发展历程三、基因治疗的发展历程v 1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋的结构模型，是分子生物学划时代意义的伟大事件，从此生命科学的研究进入到了分子水平。v 1960，Nirenberg和Khoran等人相继破解了遗传密码，揭示了从DNA到蛋白质的阅读方式为三个碱基组成的三联体对应一种氨基酸，为我们打开了解
8、人类基因奥秘的大门。v 半个世纪以来，分子生物以空前的速度迅猛发展，极大的推动了基因工程技术和基因治疗的发展。23第一次基因治疗人体实验第一次基因治疗人体实验v 1990年9月14日，NIH的Blease教授和Culver教授等人，为一位4岁女性腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症患者进行人类历史上的首次基因治疗。v ADA缺陷为常染色体隐性遗传，ADA缺乏可使T淋巴细胞因代谢产物的累积而死亡，从而导致严重的联合性免疫缺陷症（SCID）。通常婴儿出生几个月后死亡。24患者体内取出的缺陷T淋巴细胞反转录病毒改造的ADA基因改造后的正常T细胞人体25v 4个月内重复治疗4次，患者抵抗力大大增强。v 尽管该疗
9、法是否真正意义上获得成功还有争议，但是该临床试验是基因治疗历史上重要的里程碑。这是人类历史上第一个基因治疗案例。从这一年起，全世界掀起了基因治疗研究的热潮。26首例基因治疗死亡病例首例基因治疗死亡病例v 18岁的 Gelsinger成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月17日）。患者患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺陷，1999年在宾西法尼亚大学接受以编码OTC基因的腺病毒基因治疗。为获得足够的有功能的基因，通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。 v 注射后几小时患者体温升高达摄氏40.7，第二天出现昏迷。透析治疗并使用呼吸机，但肺泡腔仍充满液体，血氧浓度降低，注射后4天不幸死亡。 27v 项目负责人
10、宾西法尼亚大学的 Wilson教授 3个月后解释说：尽管给患者注射的病毒载体剂量很大，但到达肝细胞不会大于1%。v 他回顾了以往对动物和人进行的研究资料，认为使用的病毒剂量虽然比较大，但并未达到致死剂量。患者骨髓红系造血极度衰竭，可能合并有其他的遗传疾病，或者同时伴有微小病毒的感染，二者都会触发很强的免疫反应。 28v 德国研究者将与腺病毒具有相同蛋白质外壳的病毒加入18个人类血样中，触发了强烈的补体系统的反应。认为 Gelsinger的剂量会提高补体浓度并触发免疫反应。v 患者之前曾经有胸部感染，补体系统可能已经致敏，病毒蛋白可在血循环里与抗体结合，形成复合物，激活补体，引起肝脏，肺和肾脏的
11、血管壁的炎性反应，导致多器官衰竭。 29v Gelsinger去世是基因治疗临床研究开展10年来最无情的打击。v 美国FDA 取消了Wilson 从事任何临床实验的资格，这是对研究者最严厉的惩罚。v FDA还停止了宾西法尼亚大学研究所的所有基因治疗临床实验，包括对肺间皮瘤、黑色素瘤、乳腺癌、囊性纤维化、肌营养不良、神经胶质瘤的治疗。 30X-连锁连锁SCID（Bubble Boy）v IL-2R基因缺陷所致，占SCID（重症联合免疫缺陷病) 总患者80%.31v 小男孩叫大卫威特（1971-1984），自出生时便患有SCID，他的体内没有任何免疫系统，没有任何抵御细菌、病毒的能力。所以他出世2
12、0秒后，即住进了一个塑料隔离泡泡里。3233343536v 接受骨髓移植后4个月，因供体的病毒感染导致癌症去世。37v 2000年4月，法国巴黎的Marina Cavazzana-Calvo博士及其同事用反转录病毒回体基因治疗方法对11例X-连锁SCID(重症联合免疫缺陷)患者进行治疗。38v 9例治愈，能过正常的生活。这一成果获得了广泛的赞誉，被称为基因治疗领域十年来首次明确的成功。39不幸发生不幸发生v 治疗的11例患儿里，最初发现一名患儿的T细胞数显著增加，而且是单克隆增生。后被确诊为T细胞白血病，检查发现Moloney逆转录病毒载体插入了11号染色体LMO2基因的编码区，此基因的产物是
13、血细胞早期发育所必须的。40vUsing a new PCR-based technique, Christof Von Kalle of Cincinnati Childrens Hospital (and formally at the University of Freiburg Medical Center) discovered that the retroviral vector used in the French trial had inserted into more than 40 sites in the genome of different repopulating
14、cells. In the T-cell clone that grew abnormally, the vector had inserted in the LMO-2 oncogene on chromosome 11a gene originally identified as a breakpoint of a translocation that causes a type of T-cell leukemia. The retrovirus insertion appeared to have caused increased expression of the gene. 41
15、v 全世界对这不幸的孩子给予了极大的关注，虽然已经有了不利于基因治疗的证据，但是人们仍然愿意相信这与基因治疗无关。v 4个月后，该小组发生了第二例白血病。病毒载体插入了同一位置。这个孩子也发生了染色体核型的改变，出现了SIL-TAL1融合基因。v 2003年2月发现了第三例患儿，虽然还没有发生白血病，但是病毒载体的整合位点与前两例相同。 42v 在基因治疗刚刚起步的时候，人们就知道逆转录病毒会随机地整合于宿主细胞的任意位置，有可能带来意料之外的后果，但是这一直被认为是理论上的风险。现在看来过去对逆转录病毒将随机整合的认识是不确切的，这种整合至少具有一定的倾向性。v 所有涉及反转录病毒转染大量淋
16、巴细胞的实验在全世界范围内迅速被搁置起来。43v 这两起病人恶性事件极大的打击了基因治疗的发展，造成了基因治疗最为黑暗的10年。有些科学家也对基因治疗开展的过快表示担忧，并呼吁基因治疗需要“重回实验室”。v 基因治疗并非最初所设想的那么容易，基因载体转染效率太低、不恰当的基因整合，以及外源基因引起的免疫反应一直困扰着这一领域的发展。认识到瓶颈所在，找出解决问题的途径，基因治疗仍充满了希望。44v 经历过以前惨痛教训之后，人们开发出更安全有效的病毒载体，比如重组AAV2/8 系统。v 经历了黑暗的十年之后，基因治疗缓慢的走出困境，以更加成熟的姿态重回大众的视野 （2009至今）。45v 2009
17、年宾夕法尼亚大学在柳叶刀杂志报道通过AAV2过表达RPE65成功治疗Leber先天性黑蒙症2型的临床试验（LCA）。12名患者 1.5E10 or 1.5E1146v 2011年，英国伦敦大学在新英格兰杂志报道通过AAV8过表达凝血因子IX，体内凝血酶表达水平增加，出血次数大大减少的研究。v 性连锁隐性遗传47v 2012年第一例基因治疗药物Glybera（来自uniQure公司）在欧盟获批上市，开启基因治疗的新时代。该产品采用AAV1过表达的方法治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症（LPLD）。非常罕见疾病非常罕见疾病v 药物售价120万欧元，四年来只用了一次。 销售许可证到期未重新申请销售许可证到期未重
18、新申请48v 2016年欧盟第二例批准的基因治疗药物来自制药巨头葛兰素史克（GSK）的Strimvelis，用于治疗重症联合免疫缺陷病（ADA-SCID），这是基因治疗走向临床的又一个里程碑。v 59.4 万欧元万欧元v 每年每年15名患者名患者49v 2014年以来，Spark公司的SPK-RPE65治疗LCA2v Spark与辉瑞公司合作的SPK-9001治疗B型血友病v BluebirdBio公司的LentiGlobin治疗地中海贫血v uniQure的AMT-060治疗B型血友病v AVeXis公司的FDAAVXS-101等 获得美国获得美国FDA授予的授予的“突破性疗法突破性疗法”资
19、格。资格。50v RPE65基因治疗（商品名Luxturna，美国Spark Therapeutics公司）药物，2017.12.20 获得美国FDA批准上市，这是美国历史上第一款利用腺相关病毒（AAV）作为载体，“体内”直接用药，用于治疗“基因缺失遗传病”的基因治疗药物。85万美元 疗效2-3年！ 开启基因治疗的黄金时代！51v 国内基因治疗开展的较晚，不过2003年中国深圳的赛百诺公司异军突起。v 公司开发的抗肿瘤基因药物（今又生）由国家食品药品监督管理局批准生产，该注射液由通过修饰的腺病毒载体编码p53基因（抑癌基因）组成。“今又生”的获批批准，成为中国中国第一第一个获准上市的基因治疗药
20、个获准上市的基因治疗药，但是该项目的获批引起国内外的广泛争议。52四、临床基因治疗四、临床基因治疗v 遗传病的基因治疗 遗传性视网膜变性 遗传性血液病 全身系统遗传病53遗传性视网膜变性遗传性视网膜变性v 遗传性视网膜变性（Inherited retinal degeneration, IRDs）是一组以感光细胞和色素上皮细胞进行性、选择性丧失为特点的致盲性眼病，世界范围内的发病率约为1/3000 （Bessant DA et al., 2001），国内统计仅视网膜色素变性的发病率就高达1/1000（Xu L et al., 2006），是难治或不可治愈双眼盲的主要原因，目前无有效疗法。54v
21、 基因治疗之所以在IRDs上取得较好效果与眼球解剖结构有直接关系。与其它器官相比，眼球具有特殊的解剖结构，尤其适合基因治疗。 眼球屈光间质透明，有利于在可视状态下准确注射载体； 眼球在解剖上相对封闭，转基因载体只转染到眼球特定的靶细胞，很少播散到身体其他部位； 视网膜下腔具有高度的免疫赦免， 注射后基本不会引起免疫反应。5556基因替代治疗（基因替代治疗（ RPE65 ）v Leber 先天性黑朦(LCA)是德国眼科医师 Theodor Leber 于 1869 年首先报道的, 属于最严重的遗传性视网膜病变, 患儿在出生后一个月内即表现严重的视力障碍，该病多呈常染色体隐性遗传, 也有部分报道为
22、常染色体显性遗传，约有 10%20% 的盲校儿童是LCA患者, 占遗传性视网膜疾病的5% 以上。57v RPE65 基因的主要功能是结合全反式视黄酯, 使之转化为 11-顺-视黄醛, 进而合成为视紫红质来维持视网膜色素再循环的过程。因此, 当 RPE65 基因失去功能, 视网膜的光感受细胞就会因缺乏视紫红质而不能对光发生反应，导致视力丧失。在所有LCA病例中, RPE65 基因突变导致的病例大约占 15%。 58v 3名患者参加v 单眼视网膜下腔注射 1.5E10 (0.15ml)v 评价指标：瞳孔对光反射v 结果：3名患者治疗后视功能有显著性提高59v 1-2期临床试验v 12名患者参加v
23、单眼视网膜下腔注射 1.0E11(4人) or 1.0E12（8人）v 评价指标：光敏度等v 结果：高剂量组效果好；有效时间为6-12月60v 31名患者参加（2人失访） （治疗组20，对照组9人）v 患者3岁；视力20/60v 双眼先后视网膜下腔注射 1.5E11 (0.3ml)v 评价指标：multi-luminance mobility testing （多亮度移动性测试）v 结果：13名患者（65%）治疗后视功能有显著性提高616263基因编辑治疗基因编辑治疗v 21世纪以来，以核酸酶为代表的基因编辑技术蓬勃发展，跟现在常用基因替代治疗相比，利用基因编辑技术可实现目的基因DNA水平准确
24、而永久的修复，是更理想的治疗方法。v 锌指核酸酶，TALEN以及近几年火热的CRISPR-Cas9技术的应用，极大地拓展了基因治疗的策略和手段，比如我们既可以对突变基因进行原位的修复，也可以在安全位点定点整合，不仅可以实现永久的基因治疗，而且更加安全有效。64v Hunter综合症亦名粘多糖贮积症II型。性连锁隐性遗传，IDS基因突变所致，IDS基因编码艾杜糖醛酸硫酸酯酶，突变后导致粘多糖代谢障碍。v 眼部特征：视力减退、夜盲、视野缩小、角膜混浊v 全身症状：智力低下，滴水样面容，头部增大，侏儒、 肝脾肿大、关节僵硬等v 无特殊疗法 预后不良，多于10岁左右死亡。Hunter综合症基因编辑治疗
25、综合症基因编辑治疗65v 2017年11月13日，一位名为 Brian Madeux 的44岁亨特综合征患者，在加州大学旧金山分校贝尼奥夫儿童医院接受了体内基因编辑的治疗，这是世界上首次采用体内基因编辑的方式治疗遗传疾病。v 而 Madeux 之所以能活到44岁是因为他经历了脊柱压迫矫正、疝气、胆囊、眼、耳等26次手术，这也是他会接受这次风险很高的治疗的原因，死马当活马医，成功失败都是为医学做贡献了。6667v Sangamo Therapeutics 公司代号“SB-913”在研疗法的首例人体临床试验。v 该疗法应用了锌指核酸酶（ZFN）基因组编辑技术，AAV病毒载体包装运输ZFN和正确基因
26、，静脉注射给药，AAV 携带的锌指核酸酶和一个正常基因在靶向的作用下直达患者肝细胞，完成目的基因的定点修复。v 理论上1%肝细胞修复即可达到治疗效果。68v Junctional epidermolysis bullosa（JEB，交界性大疱性表皮松解症），特点是皮肤在受到轻微摩擦或碰撞后出现水疱及血疱，严重影响生活质量，严重时会导致皮肤癌。主要累及皮肤透明层。v 致病基因有LAMA3, LAMB3 和 LAMC2，编码层粘连蛋白332。常染色体隐性遗传。40%患者青春期前死亡。皮肤干细胞基因治疗皮肤干细胞基因治疗69v 2015年6月，德国Burn Unit of the Childrens Hospital，1名7岁患儿（携带LAMB3 基因纯合突变）因金葡菌和绿脓杆菌混合感染，命悬一线。70 取患者4厘米皮肤贴片 实验室修饰目的基因 生长出健康的皮肤片 移植到患者80%身体71727374
