1、主讲教师：房主讲教师：房 健健本章重点与难点本章重点与难点重点：掌握中心法则；半保留复制、半不重点：掌握中心法则；半保留复制、半不连续复制、反转录的概念；参与连续复制、反转录的概念；参与DNADNA复制复制的有关酶类和蛋白质及的有关酶类和蛋白质及DNADNA的复制过程；的复制过程；DNADNA损伤修复的方式。损伤修复的方式。难点：对难点：对DNADNA的半保留复制、半不连续复的半保留复制、半不连续复制的理解；制的理解；DNADNA合成的起始与终止。合成的起始与终止。复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以亲代（母链）是指遗传物质的传代，以亲代（母链）DNA为模板合成子链为模
2、板合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA一、一、DNADNA复制的基本规律复制的基本规律（一般原理）（一般原理）Basic Rules of DNA Replication l复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)l复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity) l双向复制双向复制(bidirectional replication)l半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) （一）（一）DNA复制是半保留复制复制是半保留复制(semi-con
3、servative replication) DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两解开为两股单链，各自作为模板股单链，各自作为模板(template)按碱基配对按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制碱基序列一致。这种复制方式称为方式称为半保留复制半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGG
4、TGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA 子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式（散布式）混合式（散布式） lDNADNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在19581958年由年由M. MeselsonM. Meselson 和和 F. Stahl
5、F. Stahl 所完成的密度飘移实验所证明。该实验首先所完成的密度飘移实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含将大肠杆菌在含1515N N的培养基中培养约十五代，使其的培养基中培养约十五代，使其DNADNA中中的碱基氮均转变为的碱基氮均转变为1515N N。将大肠杆菌移至只含。将大肠杆菌移至只含1414N N的培养基的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNADNA，作密度梯，作密度梯度离心，可得到下列结果：度离心，可得到下列结果： 密度梯度实验密度梯度实验 实验结果支持实验结果支持半保留复制半保留复制的设想。的设想。含重氮含重氮-DNA的细菌的细菌培养
6、于普培养于普通培养液通培养液 第一代第一代继续培养于继续培养于普通培养液普通培养液 第二代第二代梯度离心结果梯度离心结果按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。原核生物复制时，原核生物复制时，DNA从原点从原点 (起始点，起始点，origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相向两个方向解链，形成两
7、个延伸方向相反的复制叉，称为反的复制叉，称为双向复制双向复制。 （二）（二）DNA复制是固定起点的双向复制复制是固定起点的双向复制复制中的放射自显影图象复制中的放射自显影图象A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C真核生物每个染色体有多个复制原点，真核生物每个染色体有多个复制原点，是多复制子的复制。是多复制子的复制。习惯上把两个相邻复制原点之间的距习惯上把两个相邻复制原点之间的距离定为一个离定为一个复制子复制子(replicon) 。复制子是。复制子
8、是能够独立完成复制的功能单位。能够独立完成复制的功能单位。 53oriorioriori535533553复制子复制子3（三）（三）DNA复制是半不连续复制复制是半不连续复制3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为股链称为先导链先导链或或领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为着解链方向连续延长，这
9、股不连续复制的链称为随随后链后链或或随从链随从链。复制中的不连续片段（约。复制中的不连续片段（约1000个核个核苷酸）称为苷酸）称为岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment，1968)。 先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连先导链连续复制而随后链不连续复制，称为半不连续复制或复制的续复制或复制的半不连续性半不连续性。 二、二、DNADNA复制相关的酶和蛋白质复制相关的酶和蛋白质参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，简写聚合酶，简写
10、 为为 DDDP或或DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子（一一）复制的化学反应复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi 聚合反应的特点聚合反应的特点DNA 新链生成需新链生成需引物引物和和模板模板新链的延长只可沿新链的延长只可沿5 3 方向进行（模板方向为方向进行（模板方向为 3 5 ，合成方向为，合成方向为5 3 。）。）（二）（二）DNA聚合酶聚合酶全称：全称： DNA依赖的
11、依赖的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称简称：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性 5 3 外切酶活性外切酶活性?能切除突变的能切除突变的 DNA片段和片段和RNA引物。引物。能辨认错配的碱基对，并将其水解。能辨认错配的碱基对，并将其水解。 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 1 1、原核生物的原核生
12、物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 催化催化DNA聚合聚合参与参与DNA损损伤的应急状伤的应急状态修复态修复修复合成、修复合成、切除引物、切除引物、填补空隙填补空隙功能功能2040400分子数分子数/细胞细胞1011亚基数亚基数+-+5 外切酶活性外切酶活性+ 5 外切酶活性外切酶活性+5 聚合酶活性聚合酶活性pol IIIpol IIpol IE. Coli中的中的DNA聚合酶聚合酶功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）DNA-pol （12
13、0kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。 功能功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol ：由十种亚基组成，其中：由十种亚基组成，其中亚基具有亚基具有5353聚合聚合DNADNA的酶活性，因而具有复制的酶活性，因而具有复制DNADNA的功能；而的功能；而亚基具有亚基具有3535外切酶的活性，因而与外切酶的活性，因而与DNADNA复制的校复制的校正功能有关。正功能有关。 (250kD)2 2、真核生物的真核生物的DNADNA聚合
14、酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引
15、起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-pol填补引物填补引物空隙，切空隙，切除修复，除修复，重组重组延长子延长子链的主链的主要酶，要酶，解螺旋解螺旋酶活性酶活性线粒体线粒体DNA复复制制低保低保真度真度的复的复制制起始引起始引发，引发，引物酶活物酶活性性功能功能+-3 5 核酸外切核酸外切酶活性酶活性高高高高高高？中中5 3 聚合活性聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（分子量（kD）DNA-poll在真核生物中，目前发现的在
16、真核生物中，目前发现的DNADNA聚合酶有五种，聚合酶有五种，分别命名为分别命名为DNADNA聚合酶聚合酶（polpol ），），DNADNA聚合聚合酶酶（polpol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol ），），DNADNA聚合酶聚合酶（polpol ）。）。l其中，参与染色体其中，参与染色体DNADNA复制的是复制的是polpol （延长（延长随从链）和随从链）和polpol （延长领头链），参与线粒（延长领头链），参与线粒体体DNADNA复制的是复制的是pol pol ，polpol与与DNADNA损伤修复、损伤修复、校读和填补
17、缺口有关，校读和填补缺口有关，polpol 只在其他聚合酶只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。无活性时才发挥作用。 （三三）复制的保真性复制的保真性复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 复制的保真性和碱基选择复制的保真性和碱基选择1、DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。其聚
18、合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。2 2、复制的保真性和碱基选择复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能
19、；3. 复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 （四四）复制中的分子解链及复制中的分子解链及DNA 分分子拓扑学变化子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。1、解螺旋酶、引物酶和单链、解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白结合蛋白理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶Dn
20、aG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条单链解开成为两条单链 引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成RNA引物的酶引物的酶 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding prot
21、ein, SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整链的完整 l解螺旋酶解螺旋酶（unwinding enzyme） ，又称，又称解链酶或解链酶或rep蛋白，蛋白，是用于解开是用于解开DNA双双链的酶蛋白，每解链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消开一对碱基，需消耗两分子耗两分子ATP。目。目前发现存在至少存前发现存在至少存在两种解螺旋酶。在两种解螺旋酶。 l引发体引发体(primosome(primosome) )由引发前体与引物酶由引发前体与引物酶（primaseprimase）组装而成。）组装而成。l引物酶本质上是一种依赖引物酶本质上是一种依赖DN
22、ADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶（DDRPDDRP），该酶以），该酶以DNADNA为模板，聚合一段为模板，聚合一段RNARNA短链引短链引物物(primer)(primer)，以提供自由的，以提供自由的3-OH3-OH，使子代，使子代DNADNA链能链能够开始聚合。够开始聚合。 1010 8 8 局部解链后局部解链后2、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目目 录录拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶拓扑异构酶分分 类类拓扑
23、异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。作用机制作用机制 （五五）DNA连接酶连接酶连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段
24、相邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。功能功能三、三、DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication1 1、复制的起始复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1） DNA
25、解开成单链，提供模板。解开成单链，提供模板。2）合成引物，提供）合成引物，提供3 -OH末端。末端。（一一）原核生物的原核生物的DNA生物合成生物合成 E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3
26、5 3 a. DNA解链解链 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 b. 引发体和引物引发体和引物含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶2 2、复制的延长复制的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化
27、学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol领头链的合成领头链的合成随从链的合成随从链的合成阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四复复制制过过程程简简图图 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV405003 3、复制的终止复制的终止5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP
28、 ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接四、逆转录和其他复制方式四、逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶（一）（一）逆转录病毒和逆转录酶逆转录病毒和逆转录酶 逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶
29、双链双链DNA逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA （二二）逆转录研究的意义逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。
