1、2022-6-2312022-6-232 反映生化过程变化的参数分为两大类：一类是反映生化过程变化的参数分为两大类：一类是可以直接采用特定的传感器检测的参数称为直接可以直接采用特定的传感器检测的参数称为直接参数，包括各种反映物理环境和化学环境变化的参数，包括各种反映物理环境和化学环境变化的参数：如温度、压力、流量、搅拌功率、转速、参数：如温度、压力、流量、搅拌功率、转速、泡沫、黏度、浊度、泡沫、黏度、浊度、pH、离子强度、溶解氧和、离子强度、溶解氧和基基质浓度等。另一类是综合参数，包括细胞生长速质浓度等。另一类是综合参数，包括细胞生长速率、产物合成速率、呼吸商等。率、产物合成速率、呼吸商等。2
2、022-6-233第一节第一节 直接参数的检测和控制直接参数的检测和控制一一. 温度检测和控制温度检测和控制严格保持菌种的生长繁殖和生物合成所需的最适温严格保持菌种的生长繁殖和生物合成所需的最适温度，对稳定发酵过程，缩短周期，提高产量，具有度，对稳定发酵过程，缩短周期，提高产量，具有重要意义。重要意义。通常可以采用水银温度计、热电阻监测系统中的温通常可以采用水银温度计、热电阻监测系统中的温度。普遍使用的热电阻有铂电阻和铜电阻。铂电阻度。普遍使用的热电阻有铂电阻和铜电阻。铂电阻精度高、稳定性好、性能可靠；铜电阻超过精度高、稳定性好、性能可靠；铜电阻超过100时易被氧化。时易被氧化。为了使生物反应
3、在适当的温度下进行，必须采取措为了使生物反应在适当的温度下进行，必须采取措施施在夹套或蛇管内通入冷却水加以控制。在夹套或蛇管内通入冷却水加以控制。发酵热的测定发酵热的测定(1)通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水的通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水的进出。进出。Q发酵发酵=GC(T2-T1)/VQ发酵发酵-发酵热发酵热;C-冷却水的比热冷却水的比热G-冷却水的流量冷却水的流量;T1T2-进出口冷却水进出口冷却水的温度的温度; V-发酵液的体积发酵液的体积(2)通过罐温度的自动控制，先使罐温达到恒定，通过罐温度的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置，测量温度随时间上升的速率再关闭自控
4、装置，测量温度随时间上升的速率S。Q发酵发酵=(M1C1+M2C2)S/V(3)根据化合物的燃烧值计算发酵过程中生物热根据化合物的燃烧值计算发酵过程中生物热的近似值。的近似值。(4)测定微生物生长代谢中的耗氧量。测定微生物生长代谢中的耗氧量。通风（耗氧）发酵过程生成的发酵热数量与过通风（耗氧）发酵过程生成的发酵热数量与过程程所消耗的氧是成正比。所消耗的氧是成正比。QH=(0.1060.124)QO2(1/10)QO2QO2-氧的消耗比速氧的消耗比速(mmolO2/g菌体菌体.h)QH-发酵热生成的比速发酵热生成的比速(kcal/g菌体菌体.h)当通风发酵出现溶解氧不足时，有的的微生物当通风发酵
5、出现溶解氧不足时，有的的微生物能能够进行厌氧反应。则出现够进行厌氧反应。则出现: QH(0.1060.124)QO2二二. pH的检测和控制的检测和控制pH值可用耐灭菌的玻璃电极和银值可用耐灭菌的玻璃电极和银-汞参比电极以及汞参比电极以及pH测量仪表的检测系统检测，可连续指示罐内酸碱变化。测量仪表的检测系统检测，可连续指示罐内酸碱变化。微生物反应过程中微生物反应过程中pH的变化具有一定规律。的变化具有一定规律。在微生物细胞的生长阶段，由于所用的微生物菌种在微生物细胞的生长阶段，由于所用的微生物菌种不同，相对于接种后的起始不同，相对于接种后的起始pH值有上升或下降趋势值有上升或下降趋势在生产阶段
6、，一般反应液的在生产阶段，一般反应液的pH值趋于稳定，维持在值趋于稳定，维持在最适合产物形成的范围。最适合产物形成的范围。在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中的营养物在微生物细胞的自溶阶段，随着培养基中的营养物质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶的积累和活跃，微质的耗尽，微生物细胞内蛋白酶的积累和活跃，微生物自溶，引起培养液中的氨基氮等的增加，致使生物自溶，引起培养液中的氨基氮等的增加，致使pH值有上升。值有上升。引起反应液引起反应液pH pH 值下降的主要原因有值下降的主要原因有1.1.培养基中的碳培养基中的碳/ /氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量或者中间补糖过
7、多或溶解氧不足，致使糖等物质糖过量或者中间补糖过多或溶解氧不足，致使糖等物质氧化不完全，培养液中有机酸会大量积累，从而使氧化不完全，培养液中有机酸会大量积累，从而使pHpH值值下降下降2. 2. 消泡油加得过多；消泡油加得过多；3. 3. 微生物生理性物质的存在，使微生物生理性物质的存在，使pHpH值下降。值下降。引起反应液引起反应液 pHpH值上升的主要原因有值上升的主要原因有：1.1.培养基中的碳培养基中的碳/ /氮比例不当，碳源过多，氨基氮释放氮比例不当，碳源过多，氨基氮释放会使会使pHpH值上升。值上升。2.2.生理碱性物质存在。生理碱性物质存在。3.3.中间补料液中氨水或尿素等碱性物
8、质的加入过多。中间补料液中氨水或尿素等碱性物质的加入过多。1.调节培养基中的原始调节培养基中的原始pH值，或加入缓冲溶液制成缓冲能力值，或加入缓冲溶液制成缓冲能力强、强、pH值变化不大的培养基。值变化不大的培养基。2. 可在反应过程中加入弱酸或弱碱进行可在反应过程中加入弱酸或弱碱进行pH值的调节，进而合值的调节，进而合理地控制发酵条件，也可通过调整通风量来控制理地控制发酵条件，也可通过调整通风量来控制pH值。值。3. 进行补料，既调节了培养液的进行补料，既调节了培养液的pH值，又可补充营养，增加值，又可补充营养，增加培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步提高产率。培养液的浓度和减少阻遏作用，进一步
9、提高产率。4. 采用酸性铵盐作为氮源时，由于采用酸性铵盐作为氮源时，由于NH4+被利用后，剩下的酸被利用后，剩下的酸根会引起发酵液中的根会引起发酵液中的pH值下降，在培养液中可加入碳酸钙值下降，在培养液中可加入碳酸钙来调节来调节pH值。值。5. 根据根据pH值的变化可用流加氨水的方法来调节，同时又可把值的变化可用流加氨水的方法来调节，同时又可把氨水作为氮源供给。氨水作为氮源供给。6. 以尿素作为氮源进行流加调节以尿素作为氮源进行流加调节pH值。值。三三. 泡沫的影响和控制泡沫的影响和控制太多的泡沫给反应带来不利的影响太多的泡沫给反应带来不利的影响1. 使反应器的装填系数减少；使反应器的装填系数
10、减少；2. 造成大量逃液，导致产物的损失；造成大量逃液，导致产物的损失；3. 泡沫泡沫“顶罐顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加加了染菌的机会。了染菌的机会。4. 由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期微生物随泡沫漂浮，使微生物生长的环境发生了变化，影响了微生沫漂浮，使微生物生长的环境发生了变化，影响了微生物群体的效果，增加了微生物群体的不均一性。物群体的效果，增加了微生物群体的不均一性。5. 影响了搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼吸。影响了搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼吸。6. 使微生物提早自溶。使微生物提
11、早自溶。7. 为了控制泡沫，需加入消泡剂。对产物的提取不利。为了控制泡沫，需加入消泡剂。对产物的提取不利。微生物反应过程产生泡沫的原因微生物反应过程产生泡沫的原因1. 由外界引进的气流被机械地分散形成由外界引进的气流被机械地分散形成2. 反应过程产生的气体聚结生成的泡沫反应过程产生的气体聚结生成的泡沫培养基的物理化学性质对泡沫形成的表面现象起培养基的物理化学性质对泡沫形成的表面现象起决定作用，此外，培养基的温度、酸碱度、浓度决定作用，此外，培养基的温度、酸碱度、浓度等对过程的泡沫也有一定的影响。培养基中的蛋等对过程的泡沫也有一定的影响。培养基中的蛋白质含量越多，反应液的黏度也越大，越容易起白质
12、含量越多，反应液的黏度也越大，越容易起泡，泡沫多而且持久稳定。泡，泡沫多而且持久稳定。泡沫的控制泡沫的控制化学消泡化学消泡消泡机理：消泡机理：1.消泡剂是表面活性物质，降低气泡表面张力，消泡剂是表面活性物质，降低气泡表面张力，使气泡破裂使气泡破裂2. 降低机械强度（降低液膜的弹性）降低机械强度（降低液膜的弹性）3.降低膜表降低膜表面的黏度。面的黏度。天然油脂类、高级醇类、聚醚类、硅酮类、氟化烷烃等天然油脂类、高级醇类、聚醚类、硅酮类、氟化烷烃等生产中的一些用法：生产中的一些用法：(1)通过机械搅拌，使消泡剂更易于分散在反应液中。通过机械搅拌，使消泡剂更易于分散在反应液中。(2)将消泡剂与载体一
13、起使用，使消泡剂溶于或分散于载体将消泡剂与载体一起使用，使消泡剂溶于或分散于载体中，比如用聚氧丙烯甘油作消泡剂时，以豆油为载体的消中，比如用聚氧丙烯甘油作消泡剂时，以豆油为载体的消泡增效作用明显。泡增效作用明显。(3)多种消泡剂并用可增强消泡作用。多种消泡剂并用可增强消泡作用。(4)使用乳化剂增强消泡剂的消泡作用，如消泡剂聚氧丙烯使用乳化剂增强消泡剂的消泡作用，如消泡剂聚氧丙烯甘油用吐温甘油用吐温-80为乳化剂的增效作用可提高为乳化剂的增效作用可提高12倍。倍。机械消泡机械消泡靠机械强烈振动和压力的变化，促使细胞破裂，或借靠机械强烈振动和压力的变化，促使细胞破裂，或借助机械力将排出气体中的液体
14、加以分离回收，从而达助机械力将排出气体中的液体加以分离回收，从而达到消泡的作用。机械消泡的优点是不需在发酵液中加到消泡的作用。机械消泡的优点是不需在发酵液中加入其他物质，减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机入其他物质，减少了由于加入消泡剂所引起的染菌机会和对后续分离的影响。但是机械效果不如化学消泡会和对后续分离的影响。但是机械效果不如化学消泡迅速、可靠、不能根本上消除引起稳定泡沫的因素，迅速、可靠、不能根本上消除引起稳定泡沫的因素，而且它还需要一定的设备和消耗一定的动力。而且它还需要一定的设备和消耗一定的动力。罐内消泡、罐外消泡。罐内消泡、罐外消泡。液位电极控制消泡剂的流加液位电极控制消泡剂的流
15、加液位电极是根据空气与带有发酵液的泡沫液位电极是根据空气与带有发酵液的泡沫导电率不同的原理制造。导电率不同的原理制造。采用双位式的控制方法，当反应物液面达采用双位式的控制方法，当反应物液面达到一定的高度时，自动打开消泡剂的阀门，到一定的高度时，自动打开消泡剂的阀门，当液面降回到正常时，自动关闭消泡剂的当液面降回到正常时，自动关闭消泡剂的阀门。阀门。2022-6-2314传感器传感器（电极或探头）：能感受规定的被测量并（电极或探头）：能感受规定的被测量并按照一定的规律将其转换成可用信号的器件或装按照一定的规律将其转换成可用信号的器件或装置，它通常由敏感元件、转化元件及相应的机械置，它通常由敏感元
16、件、转化元件及相应的机械结构和线路组成。结构和线路组成。生物传感器：生物传感器：是利用酶、抗体、微生物等作为敏是利用酶、抗体、微生物等作为敏感材料，将所感受的生物体信息转换成电信号进感材料，将所感受的生物体信息转换成电信号进行检测的传感器。行检测的传感器。2022-6-2315临床检测：葡萄糖临床检测：葡萄糖85%，乳酸盐及其他，乳酸盐及其他4%，研究研究4%。药物：药物：3%环境：环境：2%食品：食品：2%机器人、国防及其他：机器人、国防及其他：1%2022-6-2316 生物传感器的结构一般是在基础传感器生物传感器的结构一般是在基础传感器(电化学电化学装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受
17、器装置）上再耦合一个生物敏感膜（称为感受器或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探头表面上，或敏感元件）。生物敏感膜紧贴在探头表面上，再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶再用一种半渗透膜与被测溶液隔开。当待测溶液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏感物液中的成分透过半透膜有选择地附着于敏感物质时，形成复合体，随之进行生化和电化学反质时，形成复合体，随之进行生化和电化学反应，产生普通电化学装置能感知的应，产生普通电化学装置能感知的O2、H2、 NH4+、CO2等，并通过电化学装置转换为电信等，并通过电化学装置转换为电信号号1)对被检测物质具有极好的选择性，噪音低。对被检测物质具有极好的选择性，噪音低。
18、2)操作简单，需用样品少，能直接完成测定。操作简单，需用样品少，能直接完成测定。3)经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感经固定化处理后，可保持长期生物活性，传感器可经得住反复使用。器可经得住反复使用。4)能在短时间内完成测定。能在短时间内完成测定。5)不要求样品具有透明度。不要求样品具有透明度。6)主要缺点是寿命较短。主要缺点是寿命较短。2022-6-2318酶传感器酶传感器微生物传感器微生物传感器免疫传感器免疫传感器细胞传感器细胞传感器组织传感器组织传感器生物电子传感器生物电子传感器2022-6-23191.传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽传感器能安装在发酵罐内耐受高压蒸汽（12013
19、5、30min以上）灭菌处理；以上）灭菌处理；2.传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在传感器及二次仪表具有长期工作稳定性，在12周内其测定误差应小于周内其测定误差应小于5%；3. 最好在使用过程中随时校正；最好在使用过程中随时校正；4. 材料不易老化，使用寿命长；材料不易老化，使用寿命长；5.传感器探头安装和使用方便；传感器探头安装和使用方便；6.探头不易被物料粘住、堵塞；探头不易被物料粘住、堵塞；7.价格便宜价格便宜2022-6-2320生物反应过程染菌的分析生物反应过程染菌的分析1. 种子培养和发酵的异常现象种子培养和发酵的异常现象种子培养异常种子培养异常异常的主要表现有菌体生长缓慢、菌
20、丝结团、菌体老化异常的主要表现有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。以及培养液的理化参数变化。发酵异常发酵异常主要表现在菌体生长速度缓慢，形态不粗壮或过早老化，主要表现在菌体生长速度缓慢，形态不粗壮或过早老化，以及糖、氮、以及糖、氮、pH、泡沫、发酵产物、发酵浓度等理化参、泡沫、发酵产物、发酵浓度等理化参数不正常。数不正常。2022-6-2321发酵异常的原因主要有种子异常和发酵条发酵异常的原因主要有种子异常和发酵条件差两方面。件差两方面。菌体生长差菌体生长差pH值过高或过低值过高或过低泡沫过多泡沫过多菌体浓度过高或过低菌体浓度过高或过低2022-6-2322zABDEF
21、GHJKLMNPQRSTUWXYZ#$%&*(-+012356789bcdefhijklmopqrsuvwxyABCDEGHIJKLNOPQRTUVWXZ#!$%&()-+02345689abcdfghijlmnoprstuvxyzABCEFGHIKLMNOQRSTUVXYZ#!%&*()+012346789acdefgijklmopqrstvwxyzBCDEFHIJKLMOPQRSUVWXY#!$%&*)-+01345679abcdfghijkmnopqstuvwyzABCDFGHIJLMNOPRSTUVWYZ#!$&*()-012346789abdefghjklmnpqrstuwxyzAC
22、DEFGIJKLMNPQRSTVWXYZ!$%&*)-+01245678abcdeghijklnopqrtuvwxzABCDEGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$%*()-+12345789abcefghiklmnoqrstuvxyzABDEFGHJKLMNPQRSTUWXYZ#$%&*(-+012356789bcdefhijklmopqrsuvwxyABCDEGHIJKLNOPQRTUVWXZ#!$%&()-+02345689abcdfghijlmnoprstuvxyzABCEFGHIKLMNOQRSTUVXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrstvwxy
23、zBCDEFHIJKLMOPQRSUVWXY#!$%&()-+01345679abcdfghijkmnopqstuvwyzABCDFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!$&*()-012346789abdefghjklmnpqrstuwxyzACDEFGIJKLMOPQRSTVWXYZ!$%&*)-+01245678abcdeghijklnopqrtuvwxzABCDFGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$%*()-+12345789abcefghiklmnoqrstuwxyzABDEFGHJKLMNPQRSTUWXYZ#$%&*(-+012356789bcdefhijklnopqrsuv
24、wxyABCDEGHIJKLNOPQRTUVWXZ#!$%&()-+02345689abcefghijlmnoprstuvxyzABCEFGHIKLMNOQRSTUVXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrstvwxyzBCDEFHIJKLMOPQRSUVWXY#!$%&()-+01345679abcdfghijkmnopqstuvwyzABCDFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!$&*()-012346789abdefghjklmnpqrstuzABCEFGHIKLMNOQRSTUVXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrstv
25、wxyzBCDEFHIJKLMOPQRSUVWXY#!$%&()-+01345679abcdfghijkmnopqstuvwyzABCDFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!$&*()-012346789abdefghjklmnpqrstuwxyzACDEFGIJKLMOPQRSTVWXYZ!$%&*)-+01245678abcdeghijklnopqrtuvwxzABCDFGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$%*()-+12345789abcefghiklmnoqrstuwxyzABDEFGHJKLMNPQRSTUWXYZ#$%&*(-+012356789bcdefhijklnopqr
26、suvwxyABCDEGHIJKLNOPQRTUVWXZ#!$%&()-+02345689abcefghijlmnoprstuvxyzABCEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrstvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%&()-+01345679abcdfghijkmnopqstuvwyzABCEFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!$&*()-012346789abdefghjklmnpqrstvwxyzACDEFGIJKLMOPQRSTVWXYZ!$%&*)-+01245678abcdeghijkmno
27、pqrtuvwxzABCDFGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$%*()-+12345789abdefghiklmnoqrstuwxyzABDEFGHJKLMNPQRSTUWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrsuvwxyABCDEGHIJKLNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689abcefghijlmnoprstuvxyzABCEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrstvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%-+012456789bcdefhijklno
28、pqrsuvwxyABCDEGHIJKLNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689abcefghijlmnoprstuvxyzABCEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrstvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%&()-+01345679abcdfghijkmnopqstuvwyzABCEFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!$&*()-012346789abdefghjklmnpqrstvwxyzACDEFGIJKLMOPQRSTVWXYZ!$%&*)-+01245678abcdeghijk
29、mnopqrtuvwxzABCDFGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$%*()-+12345789abdefghiklmnoqrstuwxyzABDEFGHJKLMNPQRSTUWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrsuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689abcefghijlmnoprstuvxyzABDEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrsuvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%&()-+01345679abcdfgh
30、ijlmnopqstuvwyzABCEFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!$&*()-012346789acdefghjklmnpqrstvwxyzACDEFGIJKLMOPQRSTVWXYZ!$%&*)-+01345678abcdeghijkmnopqrtuvwxzABCDFGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$&*()-+12345789abdefghiklmnoqrstuwxyzABDEFGHJKLMNPQRSTVWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrsuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689abce
31、fghijlmnrtuvwxzABCDFGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$&*()-+12345789abdefghiklmnoqrstuwxyzABDEFGHJKLMNPQRSTVWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrsuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689abcefghijlmnoprstuvxyzABDEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789acdefgijklmopqrsuvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%&()-+01345679abcd
32、fghijlmnopqstuvwyzABCEFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!$&*()-012346789acdefghjklmnpqrstvwxyzACDEFGIJKLMOPQRSTVWXYZ!$%&*)-+01345678abcdeghijkmnopqrtuvwxzABCDFGHIJKMNOPQSTUVWYZ#!$&*()-+12345789abdefghiklmnoqrstuwxyzACDEFGHJKLMNPQRSTVWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrtuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689a
33、bcefghiklmnoprstuvxyzABDEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012389abdefghiklmnoqrstuwxyzABDEFGHJKLMNPQRSTVWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrsuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689abcefghijlmnoprstuvxyzABDEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789bcdefgijklmopqrsuvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%&()-+02345679a
34、bcdfghijlmnopqstuvwyzABCEFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!%&*()-012346789acdefghjklmnpqrstvwxyzACDEFGIJKLMOPQRSUVWXYZ!$%&*)-+01345678abcdeghijkmnopqrtuvwxzABCDFGHIJLMNOPQSTUVWYZ#!$&*()-+12345789abdefghiklmnoqrstuwxyzACDEFGHJKLMNPQRSTVWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrtuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+023456
35、89abcefghiklmnoprstuvxyzABDEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789bcdefgijklmopqrsuvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%&()-+02345679abcdfghijlmnopqstuvwyzABCEFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!%&*()-045689abcefghiklmnoprstuvxyzABDEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#!%&*()+012356789bcdefgijklmopqrsuvwxyzBCDEFHIJKLNOPQRSUVWXY#!$%&()-+023456
36、79abcdfghijlmnopqstuvwyzABCEFGHIJLMNOPRSTUVXYZ#!%&*()-012346789acdefghjklmnpqrstvwxyzACDEFGIJKLMOPQRSUVWXYZ!$%&*)-+01345678abcdeghijkmnopqrtuvwxzABCDFGHIJLMNOPQSTUVWYZ#!$&*()-+12345789abdefghiklmnoqrstuwxyzACDEFGHJKLMNPQRSTVWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrtuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+12345689abcefghiklmnoprstuvxyzABDEFGHIKLMNOQRSTUWXYZ#$%&*()+012356789bcdefgijklmopqrsuvwxyzBCDEJKLMNPQRSTVWXYZ#$%&*(-+012456789bcdefhijklnopqrtuvwxyABCDEGHIJKMNOPQRTUVWXZ#!$%*()-+02345689abcefghikl
