1、5/31/2022体内药物分析1第八章第八章 生物样品内中药制剂生物样品内中药制剂 化学成分简介化学成分简介药物分析教研室药物分析教研室5/31/2022体内药物分析2F第一节 概述F第二节 生物样品的种类、采集、制备与贮存 F第三节 生物样品的预处理与制备 内容提要第三章 生物样品与样品制备 5/31/2022体内药物分析3第一节 概述一、生物样品内药物分析的性质、意义和任务（一）生物样品内药物分析的性质 生物样品内药物分析，又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门新兴学科。旨在通过各种分析手段，了解药物在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢
2、动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息，从未为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对栓研究的药物作出估计与评价，对药物的改进与发展作出贡献。5/31/2022体内药物分析4（二）生物样品内药物分析的意义1、生物样品内药物分析在新药评价和新药开发中的意义 大量事实证明，如无临床药理学和临床药学研究给新药以确切的评价，要做到临床安全、合理、有效地用药将会遇到许多困难。因此，加强药物在生物样品内作用机理的研究，以了解和阐明药物药物结构、理化性质、剂型及生产工艺与药物疗效等关系，已成为评价药品质量的重要内容和依据。5/31/2022体内药物分析52、生物样品内药物分析在临床
3、合理用药中的意义 影响血药浓度的因素很多，同一种给药方案难以对每一个病人都达到理想的治疗效果，为达到用药安全、合理、有效，必须设计个体化给药方案，久需要好对治疗药物监测，以血药浓度为指标，达到个体化用药。5/31/2022体内药物分析6（三）生物样品内药物分析的任务 1.1.在药物浓度监测中的应用在药物浓度监测中的应用 只有具有明确治疗范围，血药浓度和药效关系密切，且具有下列情况者，要求进行农药检测：有效血药浓度范围窄，剂量小，毒性大的药物； 药代动力学个体差异大、药理作用强、不易估计给药后的血药浓度药物； 药物的毒性反应与该药治疗的疾病症状相似，难以判断是剂量不足还是药物毒性所致； 联合用药
4、时，由于药物相互作用产生不良反应，需要调整药物剂量者； 在短期内难于判断疗效的药物，预测药物能否达到预防效果； 判断患者用药的依从性等要求进行药物浓度检测。5/31/2022体内药物分析7 2.在药代动力学研究中的应用在药代动力学研究中的应用 通常涉及药物在生物样品内的吸收、分布、代谢和排泄等过程，常研究药浓-时间曲线变化。生物制品内内源性物质的含量，对于疾病的诊断或及早预防具有重要的意义。 3.分析方法学的研究分析方法学的研究 分析方法学研究，提供合理的最佳分析条件，估计、评定各种方法达到的灵敏、专属、准确程度、探讨各种方法应用与生物样品内药物分析中的规律性，为临床药学的研究提供准确、灵敏、
5、快速的分析方法。5/31/2022体内药物分析8二、生物样品内药物分析的对象与特点 （一）生物样品内药物分析的对象 凡是生物样品内药物到达之处，如体液、器官、组织、排泄物等都是分析的对象，所以生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳汁、各种器官以及呼出的气体等。 生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也包括代谢产物，因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、结构、数量及分布情况，可了解药物在生物体内的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药物质量也是非常重要的。 由于新药进入临床试验之前，或者对老药在某一方面的重新评价，一般要求现在动物体上进行实验，
6、所以生物样品内药物分析对象不仅是人体，也包括动物体。5/31/2022体内药物分析9（二）生物样品内药物分析的特点 与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏度和选择性等方面有较高的要求。微量药物存在于大量生物介质中，样品中含内源性干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情况不同而有所不同。很多药物在生物样品内经过代谢可产生一种或多种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子结合，这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分析方法具有更高的选择性。另外，在生物样品中，药物浓度都很低，一般血药浓度在10-6-10-9 g/ml之间，且生物样品若为血液，采集量又受到一定限制，因此要求分析方法要有较高的灵敏度。
7、 1.干扰杂质多 2.样品量少 3.要求较快提供结果。5/31/2022体内药物分析10一、一、生物样品的种类、采集和制备生物样品的种类、采集和制备 血液血液(血浆、血清血浆、血清)体现药物浓度和治疗作体现药物浓度和治疗作用之间的关系用之间的关系( (联接联接) ) 最常用的生物样本最常用的生物样本第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 生生物物样样品品脏器组织脏器组织体液体液血液血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等胃液、胰液、淋巴液、粪便等5/31/2022体内药物分析11尿液尿液用
8、于药物剂量回收、尿清除率、用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定代谢分型及代谢物等的研究测定第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 唾液唾液用于某些用于某些S/PS/P较为恒定的药物较为恒定的药物 的测定的测定一、一、生物样品的种类、采集和制备生物样品的种类、采集和制备 5/31/2022体内药物分析12第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织 动物试验研究药物吸收、分布状动物试验研究药物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡态及服药过
9、量中毒死亡 毛发毛发 可用于药物滥用监测及微量元素测定可用于药物滥用监测及微量元素测定一、一、生物样品的种类、采集和制备生物样品的种类、采集和制备 5/31/2022体内药物分析13（一一）血液血液（blood）因血液中药物浓度可以较好地体因血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗作用之间的关系，现药物浓度和治疗作用之间的关系，是最为常用的生物样品是最为常用的生物样品分为分为全血、全血、血浆和血清血浆和血清第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析141.1. 血样的采集血样的采集第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 一般用注射器直接
10、采集静脉血，一般用注射器直接采集静脉血，每次每次1 1 5ml5ml；动物实验时，采血量；动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一不宜超过动物总血量的十分之一5/31/2022体内药物分析15 测定血中药物的浓度，通常是指测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血尤其是血浆，并非指全血第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 2.2. 血样的制备血样的制备5/31/2022体内药物分析16第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 采集的静脉血液置含有抗凝剂的试采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后
11、，以管中，混合后，以25002500 3000r/min3000r/min离离心心5 5 10min10min使与血球分离，所得淡黄色使与血球分离，所得淡黄色上清液即为血浆上清液即为血浆（ plasma ） 抗凝剂抗凝剂最常用的是最常用的是肝素肝素（heparin）其它抗凝剂其它抗凝剂EDTAEDTA、枸橼酸盐、草酸盐、枸橼酸盐、草酸盐等等5/31/2022体内药物分析17血血清清的制备的制备 采集的静脉血液置试管中，于采集的静脉血液置试管中，于3737或室温放置或室温放置30min 1h。血液凝固后，。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁用细竹棒或玻璃棒轻轻剥去试管壁上的血饼，再在上的
12、血饼，再在25003000 r/min离心离心510min，上层淡黄色液体即为血清，上层淡黄色液体即为血清（serum） 第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析18第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 血清比血浆只是少一种纤维蛋白原血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 C血浆= C血清 血浆比血清的分离快，而且制取血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的量约为全血的50%60%（血清为全血（血清为全血的的20%40%），多数用血浆进行分析。），多数用血浆进行分析。 若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，
13、则应使用血清样品测定有影响时，则应使用血清样品 血浆血浆与血血清的区别清的区别5/31/2022体内药物分析19 全血的制备全血的制备第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 成成分分5/31/2022体内药物分析20全血的制备全血的制备第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 某些情况血浆内药物浓度波动大，或血某些情况血浆内药物浓度波动大，或血浆浓度低，可用全血（全血净化较血浆和浆浓度低，可用全血（全血净化较血浆和血清麻烦）血清麻烦） 血浆和血浆和则应则应使用全血样品使用全血样品 例：三环类降压药在个别病人体内血浆例：三环类降压药在个别病人体内血浆和红血球中的分配比不
14、是一个常数，故宜和红血球中的分配比不是一个常数，故宜采用全血样品进行药物动力学的研究采用全血样品进行药物动力学的研究5/31/2022体内药物分析21全血制备全血制备 将采集的血液置含有抗凝剂的试将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞均相状态，即为和血细胞均相状态，即为“全血全血” ” （whole blood）第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析22 血样主要应用于：血样主要应用于： 药物动力学药物动力学 生物利用度生物利用度 临床治疗药物浓度监测临床治疗药物浓度监测第三章 生物样品与样
15、品制备第一节 生物样品的种类采集 血样的应用血样的应用5/31/2022体内药物分析23（二二）尿液尿液(urine) 尿液用于药物剂量回收、药物尿清除尿液用于药物剂量回收、药物尿清除率、生物利用度的研究，预测药物代谢率、生物利用度的研究，预测药物代谢过程、类型过程、类型 体内药物清除主要是通过尿液排出，体内药物清除主要是通过尿液排出，药物以药物以原型、原型、相及相及相代谢物相代谢物等多种等多种形式排出形式排出第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析24（二二）尿液尿液(urine) 第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 性状性状淡黄
16、色或黄褐色，相对密度淡黄色或黄褐色，相对密度 1.1051.020，pH4.88.0成分成分水、含氮化合物、盐类等水、含氮化合物、盐类等微生物微生物防腐剂防腐剂5/31/2022体内药物分析25尿液的采集尿液的采集 样本来源样本来源自然排尿自然排尿，成人一日排尿，成人一日排尿 量为量为1 1 5L5L（随时尿、晨尿、白（随时尿、晨尿、白 天尿、夜间尿及时间尿）天尿、夜间尿及时间尿）第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 样本采集样本采集一般采集一般采集时间尿时间尿（规定（规定 时间内采集尿液体积和时间内采集尿液体积和排排 入尿中的入尿中的药物总量药物总量5/31/2022体内药物
17、分析26（三三）唾液唾液 （saliva） 唾液唾液无损伤取样，易收集；一些无损伤取样，易收集；一些药物的唾液药浓药物的唾液药浓(S)(S)与血浆游离药浓与血浆游离药浓(P)(P)密切相关，因此：密切相关，因此：TDMTDM中利用对中利用对S S的测定代替对的测定代替对P P的监测的监测药代动力学的研究药代动力学的研究第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析27唾液采集唾液采集 在潄口后在潄口后15min15min，安静状态下采集，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样激下快速采样( (需注意干扰需注意
18、干扰) )第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析28唾液采集唾液采集 第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 物理法物理法：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或：口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或 纱布球等纱布球等化学法化学法：将柠檬酸或维生素：将柠檬酸或维生素C C等置于舌等置于舌 尖，弃去初始部分后采集尖，弃去初始部分后采集化学法的化学法的优点优点：缩短采样时间减小唾液：缩短采样时间减小唾液pHpH波动（波动（pH7.0pH7.0），），S/PS/P个体差异小个体差异小5/31/2022体内药物分析29 唾液样品采集后，应立即测量其唾液样品采集后，
19、应立即测量其除去泡沫部分的体积，以除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心离心10min，取上清液直接测定或取上清液直接测定或冷冻保存冷冻保存第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 唾液样品的制备唾液样品的制备5/31/2022体内药物分析30第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 非伤害性方法，病人易接受非伤害性方法，病人易接受 采集不受时间、地点限制，易收集采集不受时间、地点限制，易收集 灵敏度较高的血药浓度测定方法可灵敏度较高的血药浓度测定方法可 以直接或稍加改进使用以直接或稍加改进使用 一些药物的唾液药物浓度一些药物的唾液药物浓度( (S)S)与血浆游离与血
20、浆游离药物浓度药物浓度( (P)P)密切相关，可使用唾液样品密切相关，可使用唾液样品唾液样品的特点唾液样品的特点5/31/2022体内药物分析31 TDM如苯妥英钠的如苯妥英钠的Cs/Cp比值恒定比值恒定、个体差异小，可用于癫痫病人的个体差异小，可用于癫痫病人的TDM 药代动力学参数测定药代动力学参数测定用用GC-MS分分析测定可卡因，血浆和唾液中的析测定可卡因，血浆和唾液中的t1/2 分分别为别为3.8h和和7.9h第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 唾液样品的应用唾液样品的应用5/31/2022体内药物分析32（四四）器官组织器官组织（tissue） 第三章 生物样品与样
21、品制备第一节 生物样品的种类采集 1 1匀浆化法匀浆化法 加入一定量的水或缓冲液，在刀片式加入一定量的水或缓冲液，在刀片式匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上匀浆机中匀浆，使被测药物溶解，取上清液供萃取用清液供萃取用 方法简单、但回收率低方法简单、但回收率低组织处理的一般方法有：组织处理的一般方法有：5/31/2022体内药物分析332 2沉淀蛋白法沉淀蛋白法 在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀在组织匀浆中加入蛋白沉淀剂，沉淀蛋白质后取上清液供萃取用，操作简单、蛋白质后取上清液供萃取用，操作简单、但回收率低，较为常用但回收率低，较为常用. .第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 （
22、四四）器官组织器官组织（tissue） 5/31/2022体内药物分析34第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 3 3酸水解或碱水解酸水解或碱水解 组织匀浆中加入适量的酸或碱，置组织匀浆中加入适量的酸或碱，置水浴中加热，待组织液化后，过滤或离水浴中加热，待组织液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用心，取上清液供萃取用 适用对热稳定的药物，应用较少。适用对热稳定的药物，应用较少。（四四）器官组织器官组织（tissue） 5/31/2022体内药物分析35 组织匀浆中加入适量的酶和缓冲液，组织匀浆中加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，待组织液化后，置水浴上水解一定时间，待组织
23、液化后，过滤或离心，取上清液供萃取用过滤或离心，取上清液供萃取用 最常用的酶最常用的酶枯草菌溶素枯草菌溶素（一种细（一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在菌性碱性蛋白分解酶，可在pH7.0pH7.0 11.011.0较宽的范围内使蛋白的肽键降解，在较宽的范围内使蛋白的肽键降解，在5050 6060具有最大活力）具有最大活力）第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 4酶水解法酶水解法（四四）器官组织器官组织（tissue） 5/31/2022体内药物分析36优点优点酶解法操作简便酶解法操作简便 避免药物在酸及高温下降解避免药物在酸及高温下降解 对与蛋白结合紧密的药物，可显对与蛋白结合紧密的
24、药物，可显 著改善回收率著改善回收率 可用有机溶剂直接萃取酶解液可用有机溶剂直接萃取酶解液 而无乳化现象生成而无乳化现象生成缺点缺点不适用于在碱性下易水解的药物不适用于在碱性下易水解的药物第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 4酶水解法酶水解法（四四）器官组织器官组织（tissue） 5/31/2022体内药物分析37 （五五）头发头发（hair） 第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 应用应用 体内微量元素含量测定体内微量元素含量测定 用药史的估计用药史的估计 临床用药和药物非法滥用临床用药和药物非法滥用 的区别、毒性药物检测的区别、毒性药物检测5/31/20
25、22体内药物分析38 （五五）头发头发（hair） 优点优点取样方便、可重复采样取样方便、可重复采样通过测定某些特定的代谢物将通过测定某些特定的代谢物将 药物滥用药物滥用和和临床用药临床用药相区别相区别能获数月能获数月 数年的数年的长期用药信息长期用药信息缺点缺点预处理繁杂、干扰多预处理繁杂、干扰多分析对象的含量低、需精密仪器分析对象的含量低、需精密仪器第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析391广谱性广谱性（代谢产物及微量元素排泄器官）（代谢产物及微量元素排泄器官）2积累性积累性（长期富集各代谢产物）（长期富集各代谢产物）3稳定性稳定性（水分含量
26、少）4依时性依时性（反应某时期药物的积累）（反应某时期药物的积累）5相关性相关性 （与人体内部器官相关）（与人体内部器官相关）6指纹性指纹性（环境、饮食等）（环境、饮食等）第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析40采集采集代表性和同一性代表性和同一性 采集采集枕部枕部发样发样 微量元素在前额部位的头发中微量元素在前额部位的头发中 含量最低，枕部含量最高含量最低，枕部含量最高洗涤洗涤除去外源性污染物除去外源性污染物第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析41 毛发样品的制备毛发样品的制备1 1毛发中药物的提
27、取毛发中药物的提取常用方法：常用方法： 直接用甲醇提取直接用甲醇提取 酸水解酸水解(0.1mol/L(0.1mol/L盐酸盐酸) ) 碱水解碱水解(1mol/L(1mol/L氢氧化钠氢氧化钠) ) 酶水解酶水解( ( - -葡糖苷酸酶葡糖苷酸酶/ /芳基硫酸酯酶芳基硫酸酯酶) ) 2 2有机破坏法有机破坏法 第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析42二、二、生物样品的贮存与处理生物样品的贮存与处理 冷藏冷藏冰箱冰箱(4)中中短期保存短期保存(12d) 冷冻冷冻冷柜冷柜(-20)或低温冷柜或低温冷柜(-80) 中长期保存中长期保存冷藏或冷冻冷藏或冷冻
28、时限时限经稳定性考察后确定经稳定性考察后确定第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析43生物样品生物样品的的贮存贮存 血样血样 采集后及时采集后及时分离分离血浆和血清（血浆和血清（2h2h），），分离后分离后再贮存再贮存若不予先分离，血凝后冰冻保存，若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血则因冰冻有时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离浆或血清的分离置硬质玻璃试管中完全密塞后保存置硬质玻璃试管中完全密塞后保存第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 5/31/2022体内药物分析44尿样尿样 采集后应立即测定，
29、若不能立即测定，采集后应立即测定，若不能立即测定，加入防腐剂后保存加入防腐剂后保存 常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、常用防腐剂：甲苯、二甲苯、氯仿、醋酸、浓盐酸等醋酸、浓盐酸等 甲苯在尿液表面形成薄膜甲苯在尿液表面形成薄膜 醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长醋酸改变尿液酸碱性抑制细菌的生长 保存时间为2436h(4)或长期(-20)第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 生物样品生物样品的的贮存贮存 5/31/2022体内药物分析45唾液唾液 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在为阻止酶催化生成粘蛋白，应在44以下保存以下保存保存过程中放出二氧化碳而使保存过程中放出二氧化碳而使pHpH升高
30、，测定唾液升高，测定唾液pHpH时应在取样的当时时应在取样的当时为好为好冷冻保存唾液时，解冻后有必要冷冻保存唾液时，解冻后有必要将容器内唾液充分搅匀后再用，否则将容器内唾液充分搅匀后再用，否则测定结果会产生误差测定结果会产生误差第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 生物样品生物样品的的贮存贮存 5/31/2022体内药物分析46注意事项：注意事项： 1 1冷冻的样品测定时，需临时解冻。冷冻的样品测定时，需临时解冻。解冻后的样品应一次性测定完毕，解冻后的样品应一次性测定完毕，不不应反复冻融应反复冻融2 2如果采集的样品不能一次性测定，如果采集的样品不能一次性测定，则应以则应以小体
31、积分装贮存小体积分装贮存，每次按计划，每次按计划取一定数量进行测定取一定数量进行测定第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 生物样品生物样品的的贮存贮存 5/31/2022体内药物分析47第三节第三节 生物样品的预处理与制备生物样品的预处理与制备第三章 生物样品与样品制备5/31/2022体内药物分析48第三章 生物样品与样品制备第三节第三节 生物样品的预处理与制备生物样品的预处理与制备5/31/2022体内药物分析49本节内容：本节内容：第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析50一、一、生物样品预处理的目的生物样品预处理的目的使药物从
32、缀合物及结合物中释放使药物从缀合物及结合物中释放 测定药物的总浓度 使样品纯化使样品纯化消除生物基质中内源性物 质的干扰提高检测灵敏度提高检测灵敏度适应和符合测定方法 要求的灵敏度防止分析仪器的污染和劣化防止分析仪器的污染和劣化提高分 析仪器的耐受程度、改善分析结果第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析51（一）（一）使药物从缀合物及结合物中释放使药物从缀合物及结合物中释放药物药物吸收吸收蛋白结合物蛋白结合物相代谢相代谢代谢物代谢物相代谢相代谢缀合物缀合物 在体内存在形式：在体内存在形式： 游离型药物游离型药物 + +代谢物代谢物 + +药物或代谢物
33、与蛋白结合物药物或代谢物与蛋白结合物 + +药物或代谢物药物或代谢物相代谢的缀合物相代谢的缀合物 预处理预处理药物或代谢物从药物或代谢物从“结合物结合物”或或缀缀合物合物中释放，测定药物或代谢物的总浓度中释放，测定药物或代谢物的总浓度第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析52（二）（二）使样品纯化使样品纯化生物样品的基质生物样品的基质组成复杂、干扰多组成复杂、干扰多血清血清中含有高分子的蛋白质和低分子中含有高分子的蛋白质和低分子 的糖、脂肪、尿素等有机物，也含的糖、脂肪、尿素等有机物，也含 有有NaNa+ +、K K+ +、ClCl- - 等无机物等
34、无机物尿液尿液中含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、中含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、 NaNa+ +、K K+ +、ClCl- - 等等药物组分药物组分药物含量低，一般为药物含量低，一般为 g g或或 ngng水平，经预处理使水平，经预处理使纯化、富集纯化、富集第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析53（三）（三）提高检测灵敏度提高检测灵敏度预处理预处理降低背景噪音降低背景噪音提高灵敏度提高灵敏度 特异性强、灵敏度高的分析方法特异性强、灵敏度高的分析方法 预处理简单预处理简单 不具备分离功能的方法不具备分离功能的方法( (光谱法光谱法) ) 预处理十分重要预处
35、理十分重要第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析54（四）（四）防止分析仪器的污染和劣化防止分析仪器的污染和劣化 生物样品基质中生物样品基质中脂肪、蛋白质、脂肪、蛋白质、不溶性颗粒不溶性颗粒污染分析仪器污染分析仪器 根据分析仪器的根据分析仪器的耐受程度耐受程度，选择，选择不同的不同的预处理方法预处理方法第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析55高效液相色谱法高效液相色谱法去除血浆（或血清）去除血浆（或血清） 中的蛋白质中的蛋白质第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 （四）（四）防止分析仪器的污
36、染和劣化防止分析仪器的污染和劣化5/31/2022体内药物分析56预处理预处理改善分析结果的准确度与精密改善分析结果的准确度与精密度，延长色谱柱的寿命（除固体杂质）度，延长色谱柱的寿命（除固体杂质） 改善选择性（排除生物基质的干改善选择性（排除生物基质的干扰）扰） 改善组分可测性（被测组分的富改善组分可测性（被测组分的富集）集） 改善组分色谱行为（化学衍生化）改善组分色谱行为（化学衍生化）5/31/2022体内药物分析57二、二、样品制备时应考虑的问题样品制备时应考虑的问题 1被测组分的理化性质、存在形式、浓度范围2测定目的3生物样品种类和基质的干扰类型第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样
37、品的预处理 5/31/2022体内药物分析58二、二、样品制备时应考虑的问题样品制备时应考虑的问题 4 4样品的化学组成样品的化学组成5 5药物的蛋白结合率药物的蛋白结合率6 6被测组分在预处理过程中的稳定性被测组分在预处理过程中的稳定性7 7样品在收集、储存和预处理中容器的样品在收集、储存和预处理中容器的 污染污染8 8保证必要的专属性、灵敏度、精密度和保证必要的专属性、灵敏度、精密度和准确度的前提下预处理过程尽量简单准确度的前提下预处理过程尽量简单第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析591.药物的理化性质和存在形式药物的理化性质和存在形式酸碱性
38、酸碱性(pKa(pKa) )、溶解性、溶解性提取性质提取性质挥发性挥发性挥发损失及气相色谱法的应用挥发损失及气相色谱法的应用光谱特性光谱特性分析仪器的选择分析仪器的选择官能团性质官能团性质化学衍生化和检测器应用化学衍生化和检测器应用化学稳定性化学稳定性处理条件的选择处理条件的选择存在形式及血浆蛋白结合率存在形式及血浆蛋白结合率预处理方法预处理方法 第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析602.2.待测药物的浓度范围待测药物的浓度范围不同药物在体内中浓度相差极为悬殊不同药物在体内中浓度相差极为悬殊地高辛治疗血浓为地高辛治疗血浓为1 1 2ng/ml2n
39、g/ml水杨酸盐治疗血浓为水杨酸盐治疗血浓为20100 g/ml浓度大浓度大预处理要求稍低预处理要求稍低浓度低浓度低样品制备要求高样品制备要求高第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析613.药物测定目的药物测定目的 药物测定目的不同药物测定目的不同样品预处理的样品预处理的要求不同：要求不同：急性中毒病例急性中毒病例要求快速鉴定所怀疑的药物，应要求快速鉴定所怀疑的药物，应在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，在尽可能短的时间内获得其浓度的数据，对样品预处理的要求可以粗放些对样品预处理的要求可以粗放些第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/
40、31/2022体内药物分析623.药物测定目的药物测定目的测定药物及代谢物测定药物及代谢物要求使代谢物从缀合物中释放出要求使代谢物从缀合物中释放出来并在不同来并在不同pHpH介质中分离获得酸性、中介质中分离获得酸性、中性或碱性代谢物，对样品预处理的要求性或碱性代谢物，对样品预处理的要求全面、细致全面、细致第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析634.选用的生物样品类型选用的生物样品类型待测生物样品的类型决定样品预处待测生物样品的类型决定样品预处理方法：理方法：血浆、血清血浆、血清常需去除蛋白质常需去除蛋白质唾液唾液主要采用离心沉淀除去粘蛋白主要采用离
41、心沉淀除去粘蛋白尿液尿液常采用酸或酶法使缀合物水解常采用酸或酶法使缀合物水解头发头发需要将头发进行有机破坏后测需要将头发进行有机破坏后测 定微量元素定微量元素第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析645. 样品预处理与分析技术的关系样品预处理与分析技术的关系1.1.分析方法特点分析方法特点( (是否专属、是否具是否专属、是否具 有分离能力有分离能力) )2.2.检测系统对杂质污染的耐受程度检测系统对杂质污染的耐受程度 决定样品预处理和需要净化的程度决定样品预处理和需要净化的程度 第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体
42、内药物分析65三、三、生物样品的预处理与制备技术生物样品的预处理与制备技术 生物样品的预处理大致分为以下五类生物样品的预处理大致分为以下五类1有机破坏法2去除蛋白法3溶剂萃取法4缀合物的水解5化学衍生化法第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析66（一）有机破坏法（一）有机破坏法应用应用微量元素测定微量元素测定方法方法1 1湿法破坏湿法破坏2 2干法破坏干法破坏3 3氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析671.1. 湿法破坏湿法破坏常用试剂常用试剂硝酸或硝酸硝酸或硝酸- -高氯酸高氯酸特
43、点特点破坏能力强、反应激烈，无机破坏能力强、反应激烈，无机 金属离子为高价态金属离子为高价态应用应用适用于血、尿、组织等生物样适用于血、尿、组织等生物样 品的破坏品的破坏缺点缺点含氮杂环药物的破坏不够完全含氮杂环药物的破坏不够完全注意注意切勿蒸干、以免爆炸切勿蒸干、以免爆炸样品用量样品用量金属元素量金属元素量1010 100100 g g，血样，血样 1010 15ml15ml、尿样、尿样50ml50ml第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析68第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 高温炉高温破坏高温炉高温破坏应用应用适合人发样品的破坏
44、适合人发样品的破坏5/31/2022体内药物分析693. 氧瓶燃烧氧瓶燃烧（oxygen flask combustion）特点特点操作简单、快速、设备简单操作简单、快速、设备简单仪器装置仪器装置附图二附图二第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析70应用应用血浆、人发中血浆、人发中卤素、硫、硒卤素、硫、硒等 血血 浆浆：血浆血浆1ml1ml分次点于无灰滤纸上分次点于无灰滤纸上 6060烘干烘干按规定折叠后固定按规定折叠后固定 人发人发：洗净、干燥（洗净、干燥（60 60 80 80） 剪碎剪碎称取称取0.1 0.1 0.3g 0.3g置无灰滤纸置无灰
45、滤纸 中心中心按规定折叠固定按规定折叠固定5/31/2022体内药物分析71（二）去除蛋白质（二）去除蛋白质非破坏性生物样品预处理的第一步非破坏性生物样品预处理的第一步可使结合型药物释放可使结合型药物释放1.1.去除蛋白后取上清液直接分析测定去除蛋白后取上清液直接分析测定2.2.去除蛋白后取上清液经进一步分离去除蛋白后取上清液经进一步分离纯化、浓集后分析测定纯化、浓集后分析测定第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析72 去除蛋白质的方法去除蛋白质的方法 1. 1. 加入与水混溶的有机溶剂加入与水混溶的有机溶剂蛋白质蛋白质 脱水沉淀脱水沉淀 2. 2.
46、 加入中性盐加入中性盐“盐析盐析”沉淀蛋白质沉淀蛋白质 3. 3. 加入强酸加入强酸与蛋白质阳离子与蛋白质阳离子( (铵基铵基) ) 形成不溶性盐沉淀形成不溶性盐沉淀第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析73 去除蛋白质的方法去除蛋白质的方法 4. 4. 加入重金属盐加入重金属盐与蛋白质阴离子与蛋白质阴离子 ( (羧基羧基) )形成不溶性盐沉淀形成不溶性盐沉淀 5. 5. 超滤法超滤法半透膜滤除可溶性生物大半透膜滤除可溶性生物大 分子物质分子物质( (蛋白质蛋白质) ) 6. 6. 酶水解法酶水解法蛋白分解酶分解蛋白质蛋白分解酶分解蛋白质 7. 7.
47、 加热法加热法蛋白质变性凝固蛋白质变性凝固第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析741 1. 加入与水相混溶的有机溶剂加入与水相混溶的有机溶剂常用有机溶剂常用有机溶剂: :乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃血样与溶剂体积比血样与溶剂体积比1 (13)可除去可除去90%以上蛋白质以上蛋白质(附图三)第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 乙腈乙腈块状絮凝物、易于分离；成分损失块状絮凝物、易于分离；成分损失 可能性大，上清液可能性大，上清液pH为为8.59.5甲醇甲醇细小颗粒沉淀、不易分离；成分损细小颗粒沉淀、不易分离；成分
48、损 失可能性小，上清液失可能性小，上清液pH为为8.59.5超速离心分离（超速离心分离（12000r/min)离心离心12min5/31/2022体内药物分析752 2. 加入中性盐加入中性盐常用中性盐常用中性盐饱和硫酸铵、硫酸钠、饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等试剂用量试剂用量血清与饱和硫酸铵比例为血清与饱和硫酸铵比例为1212时除去时除去90%90%以上的蛋白质以上的蛋白质( (附图四附图四) )分离分离高速高速(12(12000r/min)000r/min)离心离心上清液液性上清液液性pH7.0pH7.0 7.77.7第三章 生物样品与样品制备第二节
49、生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析763. 加入强酸加入强酸常用的强酸常用的强酸10%10%三氯醋酸、三氯醋酸、6%6%高氯酸、高氯酸、 5%5%偏磷酸等偏磷酸等试剂用量试剂用量血清与强酸比例为血清与强酸比例为10.610.6时，除时，除 去去90%90%以上的蛋白质以上的蛋白质( (附图四附图四) )分离分离高速高速(12(12000r/min)000r/min)离心离心1 1 2min2min上清液液性上清液液性pH 0pH 0 4 4过量三氯醋酸过量三氯醋酸煮沸分解为氯仿和二氧化碳煮沸分解为氯仿和二氧化碳高氯酸高氯酸碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中
50、和 后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀后加乙醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀第三章 生物样品与样品制备第二节 生物样品的预处理 5/31/2022体内药物分析774.4. 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂加入含锌盐及铜盐的沉淀剂当溶液当溶液pHpH高于蛋白质的等电点时，蛋白高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀成不溶性盐沉淀 常用沉淀剂常用沉淀剂CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH血清与沉淀剂比例血清与沉淀剂比例1 (13)，分离，分离高速高速(10000r/min)离心离心 上清液液性上清液液性pH分别为分别为5.77.3和
