1、第六章基因克隆操作过程基因克隆操作过程概述基因克隆操作过程概述2022-6-52基因克隆操作过程VectorTarget geneRestriction endonucleaseVectorTarget gene酶切酶切VectorDNA ligase连接连接转化转化扩增扩增筛选筛选2022-6-5基因克隆操作过程3u 目的基因的体外重组目的基因的体外重组酶切和连接（酶切和连接（切、接切、接）u 重组重组DNA分子的转化和扩增（分子的转化和扩增（转、增转、增）u 目的基因转化子的筛选和鉴定（目的基因转化子的筛选和鉴定（检检）2022-6-5基因克隆操作过程4本章主要内容本章主要内容u 目的基因
2、的体外重组目的基因的体外重组切与接切与接u 重组重组DNA分子的转化和扩增分子的转化和扩增转与增转与增u 目的基因转化子的筛选和鉴定目的基因转化子的筛选和鉴定检检教学目的及要求教学目的及要求理解理解基因工程各操作步骤的原理。基因工程各操作步骤的原理。掌握掌握基因工程克隆目的基因的基本操作。基因工程克隆目的基因的基本操作。重点：重点：目的基因转化子的筛选方法。目的基因转化子的筛选方法。应用：应用：能够根据一定的研究目的，确定基因克隆能够根据一定的研究目的，确定基因克隆的策略，并设计其技术路线。的策略，并设计其技术路线。 一、目的基因的体外重组一、目的基因的体外重组切与接切与接2022-6-55基
3、因克隆操作过程In vitro Recombination of Target GeneDigestion and Ligation 1. Digestion by restriction endonuclease（切切）2022-6-56基因克隆操作过程目的目的获得线性化目的基因片段、获得线性化目的基因片段、线性化载体线性化载体作用对象作用对象目的基因片段、载体目的基因片段、载体工具：工具：限制限制性核酸内切性核酸内切酶酶Target geneVectorEcoR IPvu II 2022-6-57基因克隆操作过程Pst I2022-6-58基因克隆操作过程各种限制酶酶切反应所使用的buff
4、er（Takara）双酶联合酶切所使用的buffer（Takara）单酶切实例单酶切实例2022-6-59基因克隆操作过程双酶联合酶切实例双酶联合酶切实例2022-6-510基因克隆操作过程2. Ligation by DNA ligase（接接）2022-6-511基因克隆操作过程目的目的获得含有目的基因的重组获得含有目的基因的重组分子分子作用对象作用对象线性目的基因片段、线性化载体线性目的基因片段、线性化载体工具：工具： DNA连接酶连接酶Vector5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5GCTTAAAATTCG5 5 GCTTAA 55 AATTCG5 GCTTAAAA
5、TTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGCTTAAAATTCG5 GCTTAA 5 AATTCGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5 5GAATTCCTTAAGEcoRI退火退火T4-DNA ligaseu获得连接方向不同的两种产物获得连接方向不同的两种产物u需要鉴定目的基因的连接方向需要鉴定目的基因的连接方向（1）单酶切产生的粘性末端的连接）单酶切产生的粘性末端的连接2022-6-512基因克隆操作过程同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶。同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同。基因工程中
6、识别序列不同的同尾酶的应用性最大。 （2）同尾酶生产的粘性末端的连接）同尾酶生产的粘性末端的连接Takara网站提供的同尾酶信息网站提供的同尾酶信息2022-6-513基因克隆操作过程5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 TACTAG 55 GATCAT5 GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCAT5 TGATCAACTAGT5 GCCTAGGATCCG5 TACTAG 5 GATCATTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5 5GGATCACCTAGTBclIBamHI退火退火T4-DN
7、A ligaseu获得连接方向获得连接方向不同的两种产物不同的两种产物u需要鉴定目的需要鉴定目的基因的连接方向基因的连接方向u目的产物中对目的产物中对应位置的序列不应位置的序列不再是原来的酶切再是原来的酶切位点位点2022-6-514基因克隆操作过程5 5GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5GCCTAGGATCCG5 5 CTGCAGGACGTC5 5 CTGCAG5 GACGTC3 3 切平切平5 CG5 GC补平补平5GGATCCCTAGGATCC5 CTAGGCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGCCGATCCGCTAGG5 5GGATCGCCTAGC（3）不
8、同粘性末端的连接）不同粘性末端的连接PstIBamHIT4-DNA polymeraseKlenowT4-DNA ligaseu获得连接方向获得连接方向不同的两种产物不同的两种产物u需要鉴定目的需要鉴定目的基因的连接方向；基因的连接方向；2022-6-515基因克隆操作过程u目的产物中对目的产物中对应位置的序列不应位置的序列不再是原来的酶切再是原来的酶切位点位点（4）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接）双酶联合酶切产生的不同粘性末端的连接CTGCAGNNNNNNNNNGGATCCGACGTCNNNNNNNNNCCTAGGCTGCA GATCCG GPstIBamHIPstIBamHIGGAT
9、CC CTGCAGCCTAGG GACGTC GATCC CTGCA G G退火退火CTGCA G G GATCCG ACGTC CCTAG G T4-DNA ligaseCTGCAG GGATCCGACGTC CCTAGG u连接产物中目的基因的方向是确定的连接产物中目的基因的方向是确定的2022-6-516基因克隆操作过程5GCCTAGGATCCG5 5 GCTTAA 555 AATTCG5 55GGATCCCTAGGATCC5 CTAGG5 GAATTCTTAA 555 AATTCTTAAGGAATTGGGGGGCTTAA AATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAG
10、GATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5 5GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAGKlenow补平补平Klenow补平补平TdTdGTPTdTdCTP退火退火T4-DNA ligase（5）人工粘性末端的连接：）人工粘性末端的连接：5突出末端突出末端EcoRIBamHIBamHIBamHI2022-6-517基因克隆操作过程获得连接方向不同的两种产物获得连接方向不同的两种产物CTGCA
11、 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCCTGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTC
12、CTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火退火KlenowT4-DNA ligase（6）人工粘性末端的连接：）人工粘性末端的连接：3突出末端突出末端获得连接方向不同的两种产物获得连接方向不同的两种产物SphIPstIPstIPstI2022-6-518基因克隆操作过程5 G 3C5C3 GGTTTTTTTTTT 3CC3 TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA 3 GG3 AAAAAAAAAACC 3 GGC3 5 5GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG5 5GTTTTTT
13、TTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGGTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGTTdTdTTPTdTdATP退火退火T4-DNA ligase加热加热S1 nuclease（5）平末端的连接）平末端的连接2022-6-519基因克隆操作过程5 5GGATCCCCTAGGT4-DNA ligaseGATCC5 G5GCCTAG55 5GGATCCCTAG5 GATCCCTAGG55BamHIKlenow补平补平（6）粘性末端的更换）粘性末端的更换GGAATTCCCCTTAAGGEco
14、RI linkerGGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5 5EcoRI2022-6-520基因克隆操作过程DNA ligase介导的体外连接实例介导的体外连接实例2022-6-521基因克隆操作过程3.重组率重组率n重组率：重组率：指在基因重组实验中，获得的有目的基因的重组分子数的数目，指在基因重组实验中，获得的有目的基因的重组分子数的数目，占载体分子总数的百分比。占载体分子总数的百分比。在常规实验条件下，重组率一般为在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高
15、的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组的后续操作。n提高重组率的方法提高重组率的方法提高外源提高外源DNA片段与载体的分子比：片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1载体载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：防止载体自连分子在连接前先除去磷酸基团：防止载体自连碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶CIP、BAP2022-6-522基因克隆操作过程CTGCA 3 GG3 ACGTC5 GCATG 3C5C3 GTACGGCATGCCCCCC 3CC3 CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG 3 GG3 GGGGGGACGTC5 5GCATGCCCCCC GC GGGGGGACGTCC
16、TGCAGGGGGG CG CCCCCCGTACG5 5GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGTdTdCTPTdTdGTP退火退火KlenowT4-DNA ligase提高重组率的方法提高重组率的方法加装同聚尾末端加装同聚尾末端2022-6-523基因克隆操作过程二、重组二、重组DNA分子的转化和扩增分子的转化和扩增转与增转与增2022-6-524基因克隆操作过程1.转化的原理与技术转化的原理与技术（1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化诱导的完整细菌细胞的转化原理：原理：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于
17、诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），（如大肠杆菌等），1970年建立。其原理是年建立。其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。此时的状态叫做感受态。处于感受态的细菌，容易接受外源处于感受态的细菌，容易接受外源DNA。2022-6-525基因克隆操作过程2022-6-5基因克隆操作过程分子克隆第分子克隆第三版三版OD600=0.4左左右右26基因克隆操作过程2022-6-5分子克隆分子克隆
18、第三版第三版27n Ca2+诱导转化过程中应注意的事项诱导转化过程中应注意的事项转化所用DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%；热击过程中不要摇晃离心管；检测转化子的Amp抗性时，转化子铺平板时密度应低一些（104菌落/板）；转化子于37培养不要超过20小时。因为铺板过密或培养时间过久会导致平板上出现卫星菌落。转化过程中37温育菌体使细菌复苏时的转速不可过高，为得到较高的转化效率，应使转速小于225rpm。当用于涂板的转化液过多时，应离心浓缩（4100rpm，5min），并用适量SOC液体培养基重悬菌体沉淀后涂板。刚进行完转化的菌体比较脆弱，涂板时应轻轻涂布。2022-6-528基因克隆
19、操作过程n 提高转化效率的几个重要因素：提高转化效率的几个重要因素： 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密度 l 不要用经过多次转接或储于不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从-70或或-20甘油保存的菌种甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。l 细胞生长密度以细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养，可通过监测培养液的液的OD600 来控制。来控制。DH5菌株的菌株的OD600 为为0.5时时，细胞密度在细胞密度在5107 个个/ml左右左右(不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同)，这时
20、比较合适。这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。密度过高或不足均会影响转化效率。 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度l 用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是应主要是超螺旋超螺旋DNA(cccDNA)。l 转化效率与外源转化效率与外源DNA浓度在一定范围内成正比浓度在一定范围内成正比，但当加入但当加入的外源的外源DNA量过多或体积过大时量过多或体积过大时，转化效率就会降低。转化效率就会降低。1ng的的cccDNA可使可使50l 的感受态细胞达到饱和。的感受态细胞达到饱和。l 一般情况下一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 2022
21、-6-529基因克隆操作过程 试剂的质量试剂的质量 所用的试剂所用的试剂，如如CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的，并用超纯水配制并用超纯水配制（过滤除（过滤除菌，非高压灭菌菌，非高压灭菌），最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱最好分装保存于干燥的冷暗处（冰箱4）。）。 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿所用器皿 如离心管、枪头等最好如离心管、枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、试剂、DNA酶或杂酶
22、或杂DNA所污染所污染, 否则均会影响转化效率或杂否则均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入, 为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。为以后的筛选和鉴定带来不必要的麻烦。 2022-6-530基因克隆操作过程（2）细菌原生质体的转化）细菌原生质体的转化 适用对象：革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等），其接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常去除细胞壁后再进行转化，这与酵母菌、霉菌、植物细胞等类似。 细菌原生质体的制备：不同细菌的原生质体制备方法不尽相同。以链霉菌为例，细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终
23、悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水、无去污剂。 细菌原生质体的转化：由PEG和Ca2+介导 细菌原生质体的再生：原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。2022-6-531基因克隆操作过程（3）噬菌体噬菌体DNA的转染的转染 感受态细胞的培养：将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600 = 0.5。 吸附：加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟。 转染裂解：加入20倍体积的新鲜培养基，30继续培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。
24、2022-6-532基因克隆操作过程（4）电穿孔转化）电穿孔转化 原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。 特点：电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。2022-6-533基因克隆操作过程（5）酵母的转化一般有以下两种方法：）酵母的转化一般有以下两种方法： 利用酵母的原生质球进行转化 利用Li+盐进行转化（6）植物细胞的转化及其他基因转移方法）植物细胞的转化及其他基因转移方法 叶盘法 电击法 基因枪法 （7）哺乳动物细胞
25、基因导入法）哺乳动物细胞基因导入法 磷酸钙沉淀法 脂质体载体法 显微注射法 DEAE葡聚糖转染技术 2022-6-534基因克隆操作过程2.转化率转化率（1）转化率的定义）转化率的定义n转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。n由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微每微克载体克载体DNA转化后，
26、能够接纳转化后，能够接纳DNA的受体细胞数目，即克的受体细胞数目，即克隆数隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞无法生（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞无法生长）。长）。2022-6-535基因克隆操作过程例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108 ，意味着每微克每微克pUC18中只有中只有108个分子能进入受体细胞。个分子能进入受体细胞。一微克一微克pUC18共有共有3.41011个分子，也就是说，每个分子，也就是说，每3400个个pUC18分子中才有一个分子进入受体细胞。分子中才有一个分子进入受体细胞。另一方面，在实际操作过程中，转化一微克另一方面，在实际操作过程中，转化一微克
27、pUC18共需共需2mL感受态细胞，大约含有感受态细胞，大约含有21010 个大肠杆菌细胞，也就个大肠杆菌细胞，也就是说，每是说，每200个细胞中只有一个细胞能接纳个细胞中只有一个细胞能接纳pUC18 DNA。2022-6-536基因克隆操作过程（2）转化率的用途）转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模。重组实验规模。例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/g载体，经切、接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？（1）若重组率为）若重组率为100%，则转
28、化后产生，则转化后产生104个重组克隆需要：个重组克隆需要：104/（107/gX 10-2）= 0.1 g 载体载体DNA（2）考虑到实验系统的重组率为）考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：，所以实际投入载体应为：0.1 / 20% = 0.5 g 载体载体DNA（3）载体投入量确定后，外源）载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按的投入量即可按10 1的要求算的要求算出（出（5 g），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进，甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。行筛选。2022-6-537基因克隆操作过程（3）转化率的影响因素）转化率的影响因素l载体的空间构象：质粒的超
29、螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。l插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。l受体细胞：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高。l 供体、受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1ml 感受态细胞 50ng DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50ng DNAl 转化方法：Ca2+诱导转化：106-107/g DNA 原生质体转化：105-106/g DNA -DNA转染： 107-108/g DNA 电穿孔转化：
30、 106-109/g DNA2022-6-538基因克隆操作过程3.转化细胞的扩增转化细胞的扩增（1）扩增操作）扩增操作转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后，诱导转化后，37培养一个培养一个小时；原生质体转化后的再生过程；小时；原生质体转化后的再生过程；噬菌体转染后，噬菌体转染后，30培养培养10min等，等，均属扩增操作。均属扩增操作。（2）扩增操作的目的）扩增操作的目的增殖转化细胞；扩增和表达载体分子上的标记基
31、因；表达外源基因，以增殖转化细胞；扩增和表达载体分子上的标记基因；表达外源基因，以便于筛选和鉴定。便于筛选和鉴定。2022-6-539基因克隆操作过程三、转化子的筛选和鉴定三、转化子的筛选和鉴定检检由由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子。筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子。2022-6-540基因克隆操作过程1.载体遗传标记检测载体遗传标记检测（1）抗药性筛选法）抗药性筛选法l将外源将外源DNA片段插在片段插在BamHI位点位点非转化子呈非转化子呈 Ampr、Tcr转化子呈转化子呈 Ampr
32、、Tcs2022-6-541基因克隆操作过程Apl抗药性筛选法的基本操作抗药性筛选法的基本操作先将转化液涂布含有Amp的平板；再将Amp平板上的菌落影印影印至含有Amp和Tc的平板上；在Amp平板上生长、但在Amp和Tc平板上不长的菌落即为转化子。挑选影印Ap + Tc2022-6-542基因克隆操作过程（2）营养缺陷型筛选法）营养缺陷型筛选法n营养缺陷型筛选法的基本原理：载体分子上携带某种营载体分子上携带某种营养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组养组分的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组分，将转化细胞涂布在不含此营养组分的培养基上，长出分，将转化细胞涂布在不含此营养组分
33、的培养基上，长出的便是转化子。的便是转化子。n常见的营养缺陷型筛选标记用于大肠杆菌的营养标记基因，常选用色氨酸生物合成基因trp；用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因，常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型。2022-6-543基因克隆操作过程（3）显色筛选法）显色筛选法n显色筛选法的基本原理：载体分子上携带某种酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选。大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（编码半乳糖苷酶，蓝色反应蓝色反应）链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（编码酪氨酸酶，黑色反应黑色反应）2022-6-544基因克隆操作过程n显色筛选法的基
34、本操作显色筛选法的基本操作将外源基因克隆在pUC18的lacZ标记基因内部，使之灭活，此时转化子为Ampr、lacZ-，呈呈淡黄色或白色菌落。淡黄色或白色菌落。而非转化子则为Ampr、lacZ+，呈蓝色菌落蓝白斑筛选蓝白斑筛选。IPTG：异丙基：异丙基-D-硫代半乳糖苷；硫代半乳糖苷；X-gal：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-半乳糖苷半乳糖苷, 是是-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-galactosidase)的的显色底物显色底物2022-6-545基因克隆操作过程2.克隆克隆DNA序列检测序列检测（1）限制性酶切图谱法）限制性酶切图谱法所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进
35、行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，从而有效地鉴定转化子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。2022-6-546基因克隆操作过程用用BamHI酶切待鉴定菌落的质粒酶切待鉴定菌落的质粒DNA，电泳观察酶解产物片段。，电泳观察酶解产物片段。转化子：转化子：2.7 kb + 4.0 kb非转化子：非转化子： 2.7 kbl如果外源如果外源DNA片段也是片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶将，最好选用单一切口的酶将质粒线性化，然后通过其长度质粒线性化，然后通过其长度来鉴定其是否为转化子。来鉴定其是否为转化子。2022-6-547基因克隆操作过程l用用E
36、coRI酶切待鉴定菌落的质粒酶切待鉴定菌落的质粒DNA 转化子：转化子： 3.0 kb + 3.7 kb 或或1.0 kb + 5.7 kbl用用PstI酶切带鉴定菌落的质粒酶切带鉴定菌落的质粒DNA 转化子：转化子： 3.2 kb + 3.5 kb 或或0.8 kb + 5.9 kb2022-6-548基因克隆操作过程（2）菌落）菌落/噬菌斑原位杂交法噬菌斑原位杂交法n原理：根据克隆的目的基因或原理：根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计片段的同源序列设计探针，以此筛选含有目的基因的目的重组子。其中，探针，以此筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交同源序
37、列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。是该技术的基本理论依据。2022-6-549基因克隆操作过程n菌落原位杂交法的基本操作菌落原位杂交法的基本操作用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；用用0.4N的的NaOH溶液浸泡影印薄膜；溶液浸泡影印薄膜；用用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜；溶液浸泡清洗影印薄膜；80烘干固定影印薄膜；烘干固定影印薄膜；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；用用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜；液洗涤杂交薄膜；用用X光胶片覆盖薄膜感光。光胶片覆盖薄膜感光。（3）DNA序列分析法序列分析法DNA序列测定是精确鉴定目的基因的
38、重要手段。序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段。通过序列比对软件分析确定转化子：通过序列比对软件分析确定转化子：DNAMAN、Blast、ClustalW。2022-6-550基因克隆操作过程3.外源基因产物检测外源基因产物检测（1）蛋白质生物功能测定法）蛋白质生物功能测定法a)淀粉酶目的基因的鉴定淀粉酶目的基因的鉴定l淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基因的转化子可表达淀粉酶并分泌到胞外，均匀扩散，降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，转化子菌落周围会形成透明圈转化子菌落周围会形成透明圈。l如果透明圈不明
39、显，还可往培养板上喷洒碘液，使淀粉所在区域呈蓝色本底，易于辨认。b)蛋白酶、脂肪酶目的基因的鉴定：方法与上类似蛋白酶、脂肪酶目的基因的鉴定：方法与上类似蛋白酶：水解酪蛋白脂肪酶：水解甘油酯2022-6-551基因克隆操作过程c)抗生素抗性基因的鉴定抗生素抗性基因的鉴定抗生素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的转化子。 氨苄青霉素：Amp或Ap 卡那霉素：Kan 壮观霉素：Sp 四环素：Tc在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此
40、必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为此前的转化子是阳性转化认为此前的转化子是阳性转化子。子。2022-6-552基因克隆操作过程（2）蛋白质生物结构鉴定法）蛋白质生物结构鉴定法免疫沉淀鉴定免疫沉淀鉴定在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体；在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体；然后涂布转化液；然后涂布转化液；经培养后，转化子菌落便会分泌出目标蛋白，经培养后，转化子菌落便会分泌出目标蛋白，并与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周并与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色的圆斑。围形成白色的圆斑。n此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大。此法简便快速，但灵敏度低，抗体消耗量大。2022-6-553基因克隆操作过程
