1、基因工程基因工程专题一专题一第一节第一节DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具专题一专题一1认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。创新。2简述简述DNA重组技术所需三种基本工具的作用。重组技术所需三种基本工具的作用。(重、重、难点难点)3简述基因工程中载体需要具备的条件。简述基因工程中载体需要具备的条件。(重点重点)预预 习习 导导 学学一、基因工程的概念一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过过_和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特和转基因等技术，赋予生物以
2、新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在由于基因工程是在_水平上进行设计和施工的，因此水平上进行设计和施工的，因此又叫做又叫做_。二、二、DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1工具简介工具简介(1)“分子手术刀分子手术刀”_(2)“分子缝合针分子缝合针”_(3)“分子运输车分子运输车”_体外体外DNA重组重组 分子分子 DNA重组技术重组技术 DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(1)来源：主要是从来源：
3、主要是从_中分离纯化出来的。中分离纯化出来的。(2)功能：能够识别双链功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_断开，因此具有断开，因此具有_性。大多数限制酶性。大多数限制酶的识别序列由的识别序列由_个核苷酸组成。经限制酶切割产生的个核苷酸组成。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：片段末端通常有两种形式：_和和_。前。前者是限制酶在它识别序列的者是限制酶在它识别序列的_将将DNA的两条的两条链切开产生的，后者是限制酶在它识别序列的链切开产生的，后者是限制酶在它
4、识别序列的_切开切开产生的。产生的。原核生物原核生物磷酸二酯键磷酸二酯键专一专一6黏性末端黏性末端平末端平末端中轴线两侧中轴线两侧中轴线处中轴线处3DNA连接酶连接酶(1)分类：根据酶的来源不同，可分为两类：一类是从分类：根据酶的来源不同，可分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为大肠杆菌中分离得到的，称为_；另一类是；另一类是从从_中分离出来的，称为中分离出来的，称为T4DNA连接酶。连接酶。(2)两种两种DNA连接酶的比较：连接酶的比较：相同点：都缝合相同点：都缝合_键。键。EcoliDNA连接酶连接酶T4噬菌体噬菌体磷酸二酯磷酸二酯黏性末端黏性末端平末端平末端黏性末端黏性末端平末端平
5、末端比较低比较低有一个至多个限制酶切割位点有一个至多个限制酶切割位点 有特殊的遗传标记基因有特殊的遗传标记基因 质粒质粒动植物病毒动植物病毒结构简单结构简单独立于细菌拟核独立于细菌拟核DNA之外之外自我复制自我复制思维激活思维激活1不同的限制酶具有不同的识别序列，说明限制酶具不同的限制酶具有不同的识别序列，说明限制酶具有什么特点？有什么特点？2作为运载工具的载体，要求必须对受体细胞无害，作为运载工具的载体，要求必须对受体细胞无害，为什么？为什么？答案答案1专一性专一性2载体如果对受体细胞有害，其一旦被导入受体细载体如果对受体细胞有害，其一旦被导入受体细胞，就会影响受体细胞的生命活动，甚至破坏受
6、体的生命活胞，就会影响受体细胞的生命活动，甚至破坏受体的生命活动。动。要要 点点 精精 析析一、对基因工程概念的理解一、对基因工程概念的理解基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物知识贴士：知识贴士：基因工程得以实现的理论基础：基因工程得以实现的理论基础：所有生物的所有生物的DNA都是以都是以4种脱氧核苷酸为基本单位，种脱氧核苷酸为基本单位，构成独特的双螺旋结构，这为不同种
7、生物构成独特的双螺旋结构，这为不同种生物DNA拼接成功提供物拼接成功提供物质基础。质基础。所有生物共用一套遗传密码子，为某生物的基因能够所有生物共用一套遗传密码子，为某生物的基因能够在其他生物细胞内正常指导蛋白质的合成提供可能。在其他生物细胞内正常指导蛋白质的合成提供可能。二、基因工程的工具二、基因工程的工具1限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(1)来源：这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来来源：这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。的。(2)种类：迄今已从近种类：迄今已从近300种不同的微生物中分离出了约种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。种限制酶。(3)特点：主要切割外源特点：主要
8、切割外源DNA，而对自身的，而对自身的DNA不起不起作用，达到保护自身的目的；只能识别双链作用，达到保护自身的目的；只能识别双链DNA分子中特定分子中特定的核苷酸序列；只能在特定的部位进行切割。的核苷酸序列；只能在特定的部位进行切割。(4)结果：形成黏性末端或平末端。结果：形成黏性末端或平末端。(5)实质：使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键实质：使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。断开。知识贴士：知识贴士：若限制酶切割后形成的是黏性末端，则形成的两个黏若限制酶切割后形成的是黏性末端，则形成的两个黏性末端是反向重复序列。性末端是反向重复序列。大多数限制酶的识别序列为大多数限制酶的识别
9、序列为6个核苷酸组成，例如个核苷酸组成，例如EcoRI、SmaI限制酶识别序列由限制酶识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由制酶的识别序列由4、5或或8个核苷酸组成。个核苷酸组成。2DNA连接酶连接酶以下是两种限制酶切割后形成的以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，分片段，分析回答问题。析回答问题。解析解析分析以上分析以上4个个DNA片段，可清楚分析出为片段，可清楚分析出为平末端，连接酶应用平末端，连接酶应用T4DNA连接酶；为黏性末端且相同，连接酶；为黏性末端且相同，连接时应用连接时应用EcoliDNA连接酶。连接酶。答案答案(1)平平T4DNA连接酶
10、连接酶(2)黏性黏性EcoliDNA连接酶连接酶已知某种限制性内切酶在一线性已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有分子上有3个酶切个酶切位点，如右图中箭头所指。如果该线性位点，如右图中箭头所指。如果该线性DNA分子在分子在3个酶切位个酶切位点上都被该酶切断，则会产生点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个分子，若在每个DNA分子分子上至少有上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的
11、分子最多能产生长度不同的DNA片段种片段种类数是类数是()A3B4C9D12答案答案C解析解析每一种限制性内切酶切割每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性后会留下特征性的黏性末端，同时一次切割后，会把的黏性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且分割成两个片段，且不同的限制酶切后的片段不一样，如果将题图中的三个切割位不同的限制酶切后的片段不一样，如果将题图中的三个切割位点自左至右依次标为甲、乙、丙，只在甲处切，可产生两个片点自左至右依次标为甲、乙、丙，只在甲处切，可产生两个片段，即段，即a和右边的和右边的bcd段，如果只在乙处切，就有段，如果只在乙处切，就有ab和和cd段，如果只
12、在丙处切，就有段，如果只在丙处切，就有abc和和d段，在甲、乙两处段，在甲、乙两处同时切，就有同时切，就有a、b和和cd段，在乙、丙处同时切，就有段，在乙、丙处同时切，就有ab和和c、d段，在甲、丙两处同时切，就有段，在甲、丙两处同时切，就有a、bc、d段三种片段，段三种片段，在甲、乙、丙三处同时切，就有在甲、乙、丙三处同时切，就有a、b、c、d四种片段。所以本四种片段。所以本题应该选题应该选C。3“分子运输车分子运输车”载体载体(1)作用：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到作用：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量宿主细胞中去；二是
13、利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制的复制(称为克隆称为克隆)。(2)作为载体必须具备的条件：作为载体必须具备的条件：具有一个或多个限制酶切割位点，该切割位点必须位具有一个或多个限制酶切割位点，该切割位点必须位于载体本身必需的基因序列之外。于载体本身必需的基因序列之外。能够自我复制或整合到染色体能够自我复制或整合到染色体DNA上后随染色体上后随染色体DNA复制。复制。带有标记基因，便于筛选。带有标记基因，便于筛选。本身是安全的，不能对受体细胞产生危害。本身是安全的，不能对受体细胞产生危害。大小适中，便于操作。大小适中，便于操作。但实际上，天然载体一般不会同时具备上述条件，所以但实际上，天
14、然载体一般不会同时具备上述条件，所以在基因工程中需要对载体进行人工改造。现在所用的质粒几乎在基因工程中需要对载体进行人工改造。现在所用的质粒几乎都是人工改造的。都是人工改造的。质粒是基因工程最常用的载体，它的主要特点质粒是基因工程最常用的载体，它的主要特点是是()能自主复制不能自主复制能自主复制不能自主复制结构很小结构很小 是蛋白质是蛋白质是环状是环状RNA 是环状是环状DNA能能“友好友好”地地“借居借居”ABCD解析解析质粒存在于细菌和酵母菌等生物中，是一种很质粒存在于细菌和酵母菌等生物中，是一种很小的环状小的环状DNA，上面有标记基因，便于在受体细胞中检测。质，上面有标记基因，便于在受体
15、细胞中检测。质粒在受体细胞中能随受体细胞粒在受体细胞中能随受体细胞DNA的复制而复制，能进行目的的复制而复制，能进行目的基因的扩增和表达。基因的扩增和表达。答案答案C质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是正确的是()A质粒在宿主细胞内都要整合到染色体质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上上B质粒是独立于细菌拟核质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器之外的小型细胞器C基因工程操作中的质粒一般都是经过人工改造的基因工程操作中的质粒一般都是经过人工改造的D质粒上碱基之间数量存在质粒上碱基之间数量存在AGUC答案答案C解析解析基因工程
16、使用的载体需有一至多个酶切位点，基因工程使用的载体需有一至多个酶切位点，具有自我复制的能力，存在标记基因，对受体细胞安全，且分具有自我复制的能力，存在标记基因，对受体细胞安全，且分子大小适合。而自然存在的质粒子大小适合。而自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。而质粒进入件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。而质粒进入宿主细胞后不一定都要整合到染色体宿主细胞后不一定都要整合到染色体DNA上，如宿主细胞是细上，如宿主细胞是细菌细胞则不需整合。质粒是小型环状双链菌细胞则不需整合。质粒是小型环状双链DNA分子而不是细胞分子而不
17、是细胞器，也不会有碱基器，也不会有碱基U。思思 维维 升升 华华1与遗传有关的各种酶的比较与遗传有关的各种酶的比较名称名称作用作用参与的生理参与的生理过程与应用过程与应用作用位点作用位点(如下图如下图)DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA片片段段基因工程基因工程a限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶能够识别双链能够识别双链DNA分子的某种分子的某种特定核苷酸序特定核苷酸序列，并且使每一列，并且使每一条链中特定部位条链中特定部位的两个核苷酸之的两个核苷酸之间的磷酸二酯键间的磷酸二酯键断开断开a名称名称作用作用参与的生理参与的生理过程与应用过程与应用作用位点作用位点(如下图如下图)DNA聚合酶聚合
18、酶在脱氧核苷酸链在脱氧核苷酸链上添加单个脱氧上添加单个脱氧核苷酸核苷酸DNA的复制的复制aRNA聚合酶聚合酶在核糖核苷酸链在核糖核苷酸链上添加单个核糖上添加单个核糖核苷酸核苷酸转录转录a解旋酶解旋酶使核碱基间氢键使核碱基间氢键断裂形成单脱氧断裂形成单脱氧核苷酸链核苷酸链DNA复复制及转录制及转录b逆转录酶逆转录酶以以RNA为模板为模板合成合成DNA逆转录、逆转录、基因工程基因工程特别提醒：特别提醒：DNA连接酶和连接酶和DNA聚合酶的作用都是催聚合酶的作用都是催化形成磷酸二酯键，而不是氢键，氢键是分子间的静电吸引化形成磷酸二酯键，而不是氢键，氢键是分子间的静电吸引力，不需要通过酶的催化形成。力
19、，不需要通过酶的催化形成。DNA连接酶只能在两个连接酶只能在两个DNA片段间形成磷酸二酯键，而片段间形成磷酸二酯键，而DNA聚合酶只能将单个核苷聚合酶只能将单个核苷酸加到已有酸加到已有DNA片段上，且需要以一条片段上，且需要以一条DNA链为模板。目链为模板。目前发现的前发现的DNA连接酶不具有连接单链连接酶不具有连接单链DNA的能力。的能力。2限制酶在原核生物中的作用限制酶在原核生物中的作用原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成一套完善的防御机制，以防止外来物在长期的进化过程中形成一套完善的防御机制，以防止外来病原微生
20、物的侵害。限制酶在细菌内会将外源病原微生物的侵害。限制酶在细菌内会将外源DNA切割掉，以切割掉，以保证自身的安全。而限制酶不会切断自身保证自身的安全。而限制酶不会切断自身DNA，是因为在原核，是因为在原核生物细胞中，其生物细胞中，其DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。酶不能将其切开。知知 识识 构构 建建应应 用用 探探 究究目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为
21、基础重新组建的人工质粒，各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。建的质粒载体，其主要结构如下图所示。(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便于构建人工质粒时要有抗性基因，以便于_。(2)pBR322分子中有单个分子中有单个EcoR I限制酶作用位点，限制酶作用位点，EcoR I只能识别序列只能识别序列GAATTC，并只能在，并只能在G与与A之间切割。若在之间切割。若在某目的基因的两侧各有某目的基因的两侧各有1个个EcoR I的切点，请画出目的基因两的切点，请画出目的基因两侧 被 限 制 酶侧 被 限 制 酶 E c o R I 切
22、 割 后 所 形 成 的 黏 性 末 端 ：切 割 后 所 形 成 的 黏 性 末 端 ：_。(3)pBR322分子中另有单个的分子中另有单个的BamH I限制酶作用位点，限制酶作用位点，现将经现将经BamHI处理后的质粒与用另一种限制酶处理后的质粒与用另一种限制酶Bgl处理得到处理得到的目的基因，通过的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复连接酶作用恢复_键，键，成功获得了重组质粒，说明成功获得了重组质粒，说明_(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无为了检测上述重组质粒是否导入原本无ampR和和tetR的的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素
23、的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是的图二中的菌落表现型是_，图，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。(3)DNA连接酶催化两个连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而片段形成磷酸二酯键；而通过通过DNA连接酶作用能将两个连接酶作用能
24、将两个DNA分子片段连接，表明经两分子片段连接，表明经两种限制酶种限制酶(BamH I和和Bgl)切割得到的切割得到的DNA片段，其黏性末端片段，其黏性末端相同。相同。(4)由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamH I作用后，标记基因作用后，标记基因tetR被破坏，而不能抗四环素，故多数大肠杆菌导入的是被破坏，而不能抗四环素，故多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。质粒。
