1、专题专题5 DNA5 DNA和蛋白质技术和蛋白质技术DNA的粗提取与鉴定课题1一、基础知识一、基础知识1 1、DNADNA粗粗提取提取的原理的原理（1 1） DNADNA在在NaClNaCl溶液中的溶解度溶液中的溶解度，是随着，是随着NaClNaCl的浓的浓 度的变化而改变的。当度的变化而改变的。当NaClNaCl的物质的量浓度为的物质的量浓度为 0.14 mol0.14 molL L时时,DNA,DNA的溶解度的溶解度最低最低。（2 2）DNADNA不溶于酒精不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质溶液，但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精溶液。则可以溶于酒精溶液。：DNADNA的溶解性的溶解性
2、和和耐受性耐受性（3 3）蛋白酶蛋白酶能水解蛋白质，但是对能水解蛋白质，但是对DNADNA没有影响。没有影响。 大多数蛋白质不能忍受大多数蛋白质不能忍受60608080C C的高温，而的高温，而 DNADNA在在8080C C以上以上才会变性。才会变性。洗涤剂洗涤剂可以瓦解可以瓦解 细胞膜，但对细胞膜，但对DNADNA没有影响。没有影响。2 2、DNADNA的的鉴定鉴定原理：原理：在在沸水浴沸水浴的条件下，的条件下，DNADNA遇遇二苯胺二苯胺会被染成会被染成蓝蓝色色，因此，因此，二苯胺二苯胺可以作为鉴定可以作为鉴定DNADNA的试剂。的试剂。注意:二苯胺要现配现用二苯胺要现配现用,否则会影响
3、鉴定结果。否则会影响鉴定结果。二、实验设计二、实验设计1 1、实验材料的选取、实验材料的选取原则上只要原则上只要含含DNADNA的生物材料都可以，但是选的生物材料都可以，但是选取取DNADNA含量相对较高含量相对较高的生物组织，成功率的生物组织，成功率更大更大。2 2、破碎细胞，获取含、破碎细胞，获取含DNADNA的滤液的滤液 在在鸡血细胞液鸡血细胞液中加入一定量中加入一定量蒸馏水蒸馏水并用玻棒并用玻棒搅拌，搅拌，过滤过滤后收集滤液；后收集滤液； 切碎切碎洋葱洋葱，加入一定量，加入一定量洗涤剂洗涤剂和和食盐食盐，搅拌，搅拌研磨，研磨，过滤过滤后收集滤液。后收集滤液。血细胞在血细胞在蒸馏水蒸馏水
4、中大量吸水而张裂；中大量吸水而张裂；洗涤剂洗涤剂瓦解细胞膜，有利于瓦解细胞膜，有利于DNADNA的释放；的释放；食盐食盐溶解溶解DNADNA物质；物质；选用选用尼龙布尼龙布进行过滤。进行过滤。高中生物高中生物3、去除滤液中的杂质、去除滤液中的杂质方案一方案一原理原理：DNADNA在不同浓度在不同浓度NaClNaCl溶液中溶解度不同；溶液中溶解度不同； 方法：用方法：用NaClNaCl反复溶解和析出反复溶解和析出DNADNA。方案二方案二原理原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解：蛋白酶分解蛋白质，不分解DNADNA； 方法：加嫩肉粉（含方法：加嫩肉粉（含木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶）。）。方案三方案三原理原理
5、：蛋白质和：蛋白质和DNADNA的变性温度不同。的变性温度不同。 方法：将滤液放在方法：将滤液放在60607575的恒温水浴箱中。的恒温水浴箱中。（三个方案）（三个方案）高中生物高中生物4 4、DNADNA析出与鉴定析出与鉴定试管试管2 2支，编号甲乙支，编号甲乙各加各加5mL2mol/L5mL2mol/L的的NaClNaCl溶液溶液甲中放入少量白色丝状物，甲中放入少量白色丝状物，使之溶解使之溶解各加各加4mL4mL二苯胺，混合均匀二苯胺，混合均匀沸水浴沸水浴5min5min观察颜色变化观察颜色变化滤液与等体积的滤液与等体积的冷却酒精冷却酒精（体积分数（体积分数95%95%）混合均匀，静置混合
6、均匀，静置2 23 3分钟，析出的分钟，析出的白色丝白色丝状物状物就是就是DNADNA。析出：析出：鉴定：鉴定：多聚酶链式反应扩增DNA片段课题2高中生物高中生物一、基础知识一、基础知识高中生物高中生物1、PCR原理：原理：与与细胞内细胞内DNA复制类似复制类似高中生物高中生物在在PCR技术中：技术中：扩增方向扩增方向：DNADNA的合成方向总是从的合成方向总是从子链的子链的55端端 向向33端端延伸。延伸。解旋解旋：利用了：利用了DNADNA的热变性的热变性原理，通过控制温原理，通过控制温 度来控制双链的解聚与结合。度来控制双链的解聚与结合。酶酶: :耐高温耐高温的的TaqTaqDNADNA
7、聚合酶，高温不会失活。聚合酶，高温不会失活。条件条件：一定的：一定的缓冲溶液缓冲溶液下才能进行，需提供下才能进行，需提供DNADNA 模板模板、两种、两种引物引物、四种、四种脱氧核苷酸脱氧核苷酸、耐热、耐热 的的DNADNA聚合酶聚合酶，同时要控制，同时要控制温度温度。高中生物高中生物2、PCRPCR的反应过程：的反应过程：每个循环包括：每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸要经历要经历三十多次三十多次循环循环变性（变性（模板模板DNADNA解旋解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上。一定时间后，以上。一定时间后，使模板使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPC
8、R扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。为下轮反应作准备。复性（复性（退火退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链后，温度降到经加热变性成单链后，温度降到50500 0C C左右左右，引物与模板，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合。单链的互补序列配对结合。延伸延伸DNADNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶的作用的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成基互补配对的原则
9、与半保留复制的原理，合成一条新的一条新的DNADNA链。链。高中生物高中生物 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且以作为模板参与反应，并且由引物由引物延伸而成的延伸而成的DNADNA单链会与引物单链会与引物结合，进行结合，进行DNADNA的延伸，的延伸，这样，这样，DNADNA聚合酶只能特异性地复制聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的处于两个引物之间的DNADNA序列序列，使这段固定长度的序列呈，使这段固定长度的序列呈指数指数扩增。扩增。准备准备好好PCR反应体系的配方反应体系的配方用用微量移液器微量移液器按配方在往微量按配方
10、在往微量离心管中加入各组分离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁壁混合混合反应液反应液离心离心10s将离心管放入将离心管放入PCR仪上，设置好仪上，设置好循环程序进行循环程序进行反应反应二、实验步骤：二、实验步骤：高中生物高中生物高中生物高中生物三、结果分析与评价三、结果分析与评价1 1、反应液稀释反应液稀释： 取取2 2 LPCRLPCR反应液，添加反应液，添加9898 L L蒸馏水；蒸馏水；2 2、分光光度计调零分光光度计调零： 将将100100 L L蒸馏水添加到比色杯中，在蒸馏水添加到比色杯中，在260nm260nm 处将分光光度计调整读数为零。处将分
11、光光度计调整读数为零。3 3、测定测定：将将100100 L L反应稀释液倒入比色杯中，测反应稀释液倒入比色杯中，测 定在定在260nm260nm处的光吸收值。处的光吸收值。4 4、计算计算：DNADNA含量含量5050光吸收值光吸收值稀释倍数稀释倍数DNA在在260nm的的紫外线紫外线波段有一强烈的吸收峰波段有一强烈的吸收峰血红蛋白的提取和分离课题3高中生物高中生物一、基础知识：一、基础知识：高中生物高中生物（一）（一） 凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）：）： 1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡
12、聚糖、琼脂糖，具多孔的凝由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）胶就叫分子筛）根据被根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。行分离。2、概念：、概念：高中生物高中生物当不同的蛋白质通过凝胶时，相对当不同的蛋白质通过凝胶时，相对相对分子相对分子质量较小质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程路程较长较长，移动速度，移动速度较慢较慢；而；而相对分子质量相对分子质量较大较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只的蛋白质无法进入凝胶内
13、部的通道，只能在能在凝胶外部凝胶外部移动，路程移动，路程较短较短，移动速度，移动速度较较快快。3、原理：、原理：4 4、具体过程：、具体过程：高中生物高中生物（二）（二） 缓冲溶液：缓冲溶液：高中生物高中生物抵制外界酸、碱对溶液抵制外界酸、碱对溶液pHpH的干扰而的干扰而保持保持pHpH稳定。稳定。1、原理：、原理：由由弱酸弱酸和相应的和相应的强碱弱酸盐强碱弱酸盐组成（如组成（如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等）。等）。2、配制：、配制：调节酸和盐的用量，可配制不同调节酸和盐的用量，可配制不同pHp
14、H的缓冲液。的缓冲液。3、作用：、作用：高中生物高中生物 在血红蛋白整个实验室中用的缓冲在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是液是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模，目的是利用缓冲液模拟细胞内的拟细胞内的PHPH环境，保证血红蛋白的正环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）料的科学研究（活性）1、原理：、原理：不同蛋白质的不同蛋白质的带电性质带电性质、电量电量、形状形状和和大小大小不同，不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的导致不同蛋白质在电场中的
15、运动方向运动方向和和运动速度运动速度不同。不同。 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。在一定在一定pHpH下，使蛋白质基团带上正电或负电；下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的加入带负电荷多的SDSSDS，形成，形成“蛋白质蛋白质SDSSDS复合复合物物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 (三三)电泳：电泳：指带电粒子在电场作用下发指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。生迁移的过程。高中生物高中生物2、分离方法：、分离方法：3、分离过程：、分离过程：二、实验操作实验步骤二、实验操作实验步骤样品处理样品处理
16、粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定 血液组成成分血液组成成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 4.透析透析血红蛋白血红蛋白高中生物高中生物血液组成成分血液组成成分阅读思考：阅读思考：1. 血液由血液由_和和_两部分组成。两部分组成。2. 血细胞中血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是最高的化合物是_。3. 该化合物是由该化合物是由 _和和_构构成的，其中每个亚基中都含有一个能与成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和和CO2结合的结合的_基团。基团。血浆血浆血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血
17、红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素血血液液血浆血浆水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白两个两个a a肽链肽链两个两个一肽链一肽链高中生物高中生物血液组成成分血液组成成分:1、样品处理、样品处理高中生物高中生物（1）红细胞的洗涤）红细胞的洗涤 除去血浆蛋白等杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。除去血浆蛋白等杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆5倍体积生理盐
18、水倍体积生理盐水缓慢搅拌缓慢搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色高中生物高中生物（2）血红蛋白的释放：）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放。目的分析：1. 蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。2. 加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。3. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂(3)分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过
19、滤脂类物质脂类物质烧杯烧杯高中生物高中生物(4)(4)透析：透析：在透析过程中，血红蛋白溶液中的在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子离子和和小分子小分子不断通过半透膜扩散进入到不断通过半透膜扩散进入到pHpH7 7的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中。中。pH7的磷酸缓冲液维持血红蛋白的正常特性。缓冲液量远多于血红蛋白溶液量有利于杂质分子充分地向外扩散。高中生物高中生物2、粗分离、粗分离高中生物高中生物3、纯化、纯化（1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：（2）凝胶色谱柱的装填：）凝胶色谱柱的装填：教材图教材图519（3) )样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱-透析透析除去分子较小的杂质除去分子较小的杂
20、质-凝胶色谱操作凝胶色谱操作材料：材料：交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液装填装填:（2）凝胶色谱柱的装填：）凝胶色谱柱的装填：步骤步骤操作要求操作要求立刻用立刻用磷酸缓冲液磷酸缓冲液洗涤平衡洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡一次性一次性缓慢缓慢倒入；轻轻倒入；轻轻敲打敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱色谱柱垂直垂直固定在支架上固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱高中生物高中生物(3)(
21、3)样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱基本过程：基本过程：调节缓冲液面调节缓冲液面加入蛋白质样品加入蛋白质样品调节缓冲液面调节缓冲液面洗脱洗脱收集分装蛋白质收集分装蛋白质高中生物高中生物注意注意：正确的加样操作：正确的加样操作1 1、不要触及破坏凝胶面不要触及破坏凝胶面2 2、贴壁加样贴壁加样3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动、使吸管管口沿管壁环绕移动高中生物高中生物4、纯度鉴定：通过、纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定鉴定高中生物高中生物红细胞的洗涤：红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 凝胶的预处理：凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡色谱柱的装填：色谱柱的装填： 装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。红色区带均匀一致地移动。高中生物高中生物作业作业 名师一号谢谢合作！谢谢合作！高中生物高中生物
