1、南京农业大学生命科学学院南京农业大学生命科学学院农业部农业环境微生物工程重点开放实验室农业部农业环境微生物工程重点开放实验室 近年来，化学合成工业的发展给环境带来了大量异生物质（xanobiotics），导致环境污染日益严重、生态破坏不断加剧。 研究生物系统与被污染的环境系统之间的相互作用规律及采用生态学原理和方法对污染环境进行控制和修复研究成为目前研究的热点。 化学农药是一类重要的环境污染物，其土壤环境的污染与效应引起了广泛的重视。 被污染的环境系统与生物系统之间的相互作用是一个动态过程，土壤微生物群落结构及其变化能否成为评价土壤污染的分子指标之一？对照土壤样品： 未污染土壤污染土壤样品：
2、受甲基对硫磷20多年污染的土壤实验材料（土壤）：个/g.干土 107 106 103 101 103 土壤 土壤微生物活性呼吸作用 CO2量ml/100 g干土氨化作用 10ml培养液增加铵量mg硝化作用强度（%）对照土壤5.580.5448.618.991.42污染土壤3.910.8463.378.6889.99构建路线构建路线两种土壤总DNA的提取纯化 细菌混合16S rDNA的PCR扩增T-VECTOR T/A克隆转化E.coli DH5 感受态细胞，挑取白斑转化子保存 限制性内切酶： Hha：GCGC Rsa：GTAC Clone of unique phylotypeTotal ph
3、ylotypesUnique phylotypesTotal clonescommon phylotypesClone of common phylotypesrare phylotypes74.36%72.50%69.42%67.22%25.64%27.49%30.58%32.78%81.73%71.13% 土壤 多样性参数 丰富度（d）香农-威纳指数（H）均匀度（E）辛普森指数(D) 对照土壤51.929 8.142 0.983 0.995 污染土壤 47.936 7.811 0.943 0.951污染土壤中优势类群的分类地位 常规分析技术与基于常规分析技术与基于16S rDNA的土壤的土
4、壤微生物群落结构分析结果趋于一致，越微生物群落结构分析结果趋于一致，越来越多的证据显示该方法可以成为土壤来越多的证据显示该方法可以成为土壤污染的分子判别的指标之一。污染的分子判别的指标之一。mp-1 Pseudaminobactermp-2 Alcaligenesmp-3 Ochrobactrummp-4 Ochrobactrummp-5 Ochrobactrummp-6 Ochrobactrummp-7 Brucella有机磷农药降解菌的培养特征有机磷农药降解菌的培养特征形态特征菌株mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7菌体形状杆状杆状杆状杆状杆状杆状短杆状大小(长宽um)
5、1.390.521.840.891.630.821.580.791.550.871.470.741.390.53菌落颜色 微黄色乳白乳白乳白乳白乳白乳白菌落形状圆形圆形圆形圆形圆形圆形圆形菌落边缘整齐整齐整齐整齐整齐整齐整齐鞭毛周生一根端生周生周生周生周生周生运动性运动运动运动运动运动运动运动降解菌的生理生化特征降解菌的生理生化特征生化特征菌株编号mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7革兰氏染色阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性氧化酶阳性弱阳性阳性弱阳性阳性阳性阳性接触酶阳性阳性弱阳性弱阳性阳性阳性阳性乙醇氧化阴性阴性阳性阳性阳性阳性阳性淀粉水解阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性葡萄糖氧
6、化产酸不氧化产酸产酸产酸产酸产酸葡萄糖发酵不发酵不发酵不发酵不发酵不发酵不发酵不发酵石蕊牛乳反应凝乳酶凝固胨化酸凝固酸凝固胨化胨化胨化V.P反应阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性吲哚反应阴性阴性阴性阴性阴性阴性阴性菌株 mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7mp-1100mp-277.36 100mp-393.48 76.54 100mp-493.39 76.40 99.58 100mp-593.41 77.35 98.02 98.24 100mp-693.33 77.15 97.95 98.17 99.79 100mp-793.48 76.31 98.52 98.67 97.45
7、 97.37 100降解菌降解菌16S rDNA16S rDNA序列的相似性距阵序列的相似性距阵有机磷农药有机磷农药 菌株编号mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7甲基对硫磷+乙基对硫磷+辛硫磷+三唑磷-+ +-吡虫磷-甲基异柳磷-毒死蜱+降解菌对有机磷化学农药的降解谱降解菌对有机磷化学农药的降解谱 芳香族化合芳香族化合物物底物底物菌株编号菌株编号mp-1mp-1mp-2mp-2mp-3mp-3mp-4mp-4mp-5mp-5mp-6mp-6mp-7mp-7对硝基酚+邻硝基酚-邻苯二酚-对苯二酚-+间苯二酚-邻氨基苯酚-间硝基苯酚-2.4-二硝基苯酚-4-硝基儿茶酚+-+-降
8、解菌对芳香族化合物的降解降解菌对芳香族化合物的降解 这些降解菌在形态、生理生化特征、降解谱、16S rDNA相似性、ERIC 指纹图谱等方面存在广泛的多样性。降解菌多样性降解基因的保守性Any relationship?降解基因是通过水平转移而来？降解基因是通过水平转移而来？基因水平转移是降解基因分布在不同种群中的分子机制？基因水平转移是降解基因分布在不同种群中的分子机制？降解基因的水平转移是微生物适应污染生态的机理之一？降解基因的水平转移是微生物适应污染生态的机理之一？（1）进化上相近的降解基因（簇）从地理位置上很远的细菌中被发现；（2）同一污染物不同菌株降解基因的系统进化关系与宿主菌16S
9、 rDNA的系统发育关系不一致；（3）降解有机污染物的基因与自转移质粒或转座子等MGEs相连；（4）降解基因（簇）G+C%含量与宿主菌的明显不同，一般也认为降解基因是通过水平转移获得的。 基因水平转移的证据： 通过鸟枪法建库克隆了菌株的降解基因，获得了大片段的包含降解基因上下游序列在内的全部基因信息基于16S rDNA序列基于有机磷农药水解酶基因序列进化关系不一致1291bpTnpAIRLIRRIRR：TTTGCAACAGAGCC IRL：GGCTCTGTTGCAAA 1、污染环境中的水平基因转移在代谢转座子的扩散以及新的代谢途径形成中发挥着重要的作用，使细菌群落能更快的适应污染环境。 2、降解基因水平转移的另一个重要作用是有力的促进了一些生境中污染物的降解。携带污染物代谢转座子的宿主菌接种至污染环境中，代谢转座子可以向土著微生物转移，从而增强微生物修复农药残留面源污染的效果。 降解基因水平转移在污染环境中功能与作用：Thank YouThank You
