1、第一章 组培的基本条件及一般技术植物组织植物组织培养实验培养实验室的构建室的构建和操作技和操作技术术第一章 组培的基本条件及一般技术第一节第一节 实验室及主要设备实验室及主要设备 第一章 组培的基本条件及一般技术主要内容主要内容 植物组织培养的设计原则 组培室的组成及其功能 无菌操作设备 常用工具 常用仪器设备第一章 组培的基本条件及一般技术组织培养实验室布局的总体要求便于隔离便于隔离便于操作便于操作便于灭菌便于灭菌便于观察便于观察第一章 组培的基本条件及一般技术实验室设计原则实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。 实验室的大小应取决于工作的目的和规模实验室的大小应取决于工作的
2、目的和规模 按按组织培养流程组织培养流程来设计，避免某些环节倒来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱排，引起日后工作混乱 利用一定的设备、器材和特殊的实验室结利用一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件构设计，达到严格无菌的条件第一章 组培的基本条件及一般技术一、实验室设置及仪器设备 实验室是进行组培研究的主要场实验室是进行组培研究的主要场所，应能满足清洗、培养基制备、所，应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。方面的工作。第一章 组培的基本条件及一般技术辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实
3、验室温 室生化分析实验室基本实验室基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁 架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室A Glimpse of Plant Tissue Culture第一章 组培的基本条件及一般技术（1）准备室）准备室 所需器具的清洗、干燥和保存所需器具的清洗、干燥和保存 培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌 生理生化测定等生理生化测定等组织培养准备实验室 1 1）洗涤间洗涤间 根据工作量的大小决定其大小，一般根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在面积控制在30-50m3
4、0-50m2 2。在实验室的一侧设置。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置央实验台还应配置2 2个水槽，用于清洗小型个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台玻璃器皿。如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。准备洗瓶机。准备1-21-2个洗液缸，专门用于洗涤个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。器等。地面应耐湿并排水良好。 面积面积60平方米左右，配备的主要仪器设
5、平方米左右，配备的主要仪器设备有备有 ：冰箱、天平、微波炉、：冰箱、天平、微波炉、pH计、培养计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积体积180-200L为宜，用于储存培养基母液、为宜，用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。存植物材料。天平应有不同感量。2）培养基配制间）培养基配制间 配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、
6、细配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。 如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房一个
7、准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。3） 消毒间消毒间（2 2）缓冲室缓冲室（注意门的朝向）（注意门的朝向） 工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩罩 功能功能 减少人体从外界带入的尘埃等污染物。减少人体从外界带入的尘埃等污染物。 要求要求 缓冲间需缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌；平方米，应保持清洁无菌； 有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服； 1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。行
8、灭菌。无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫无菌操作室主要用于实验材料的接种操作，所以又叫接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于接种室。通常由里外两间组成，外间是缓冲间，用于准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与准备工作，还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员
9、进入作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。 室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种室内应配有超净工作台，紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。接种器械等。 （3） 无菌操作室无菌操作室无菌室（一）无菌室（二） 为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用
10、水磨石或瓷砖铺设，和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室外应有一预备间或走廊。 培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W，固定，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在离在20cm，光照强度为，光照强度为2000-3000lx。（4）培养室）培养室培养室l 植物组织培养材
11、料移到田间前，通常植物组织培养材料移到田间前，通常先移到温室进行练苗，待生根成活后，先移到温室进行练苗，待生根成活后，再移到大田。再移到大田。2 2辅助实验室辅助实验室（1）鉴定室鉴定室 细胞学鉴定室细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。系统等。 生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培室
12、中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。养物的有效成分随时进行取样检查。 离心机、酶离心机、酶联免疫检测仪、天平、联免疫检测仪、天平、PCRPCR仪等。仪等。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。（2）温室）温室（一）无菌操作设备一）无菌操作设备 .烘箱：烘箱： 作用作用：干燥洗后的器皿：干燥洗后的器皿l 高温干热灭菌高温干热灭菌l 测定培养物的干重时烘干培测定培养物的干重时烘干培l 养材料。养材料。 2.灭菌锅灭菌锅l类型类型：普通医用消毒锅：普通医用消毒锅l 大的高压灭菌锅大的高压灭菌锅l作用作用：培养基、水和各种用具的消
13、毒：培养基、水和各种用具的消毒3.超净工作台超净工作台l陈列于操作室（接种室）内陈列于操作室（接种室）内l类型类型：垂直式和水平式：垂直式和水平式l作用作用：无菌操作：无菌操作（二）药品贮存和配制仪器设备（二）药品贮存和配制仪器设备1.冰箱冰箱l作用作用：低温保存材料，存：低温保存材料，存放药品、培养基母液、激放药品、培养基母液、激素、酶制剂。素、酶制剂。2.天平天平l陈列于制备室中陈列于制备室中l作用：作用：称取大量元素、微量称取大量元素、微量元素、酶制剂元素、酶制剂3.酸度计酸度计l陈列于制备室中陈列于制备室中l作用作用：测定培养基及酶制剂的：测定培养基及酶制剂的pH值值PHS-802中文
14、台式酸度计中文台式酸度计通用型或经济型酸度计通用型或经济型酸度计（三）观察分析仪器设备（三）观察分析仪器设备l显微镜显微镜l类型：类型：l 倒置显微镜倒置显微镜 原生质体观察原生质体观察l 普通显微镜普通显微镜 染色体和叶片气孔观察染色体和叶片气孔观察l 荧光显微镜荧光显微镜 细胞活力观察细胞活力观察l 电子显微镜电子显微镜 病毒检测、细胞器变化病毒检测、细胞器变化l 体视显微镜体视显微镜 形态分化的实体观察形态分化的实体观察（四）培养设备（四）培养设备1.空调空调l作用：控制培养温度作用：控制培养温度2.加湿器和去湿机加湿器和去湿机l控制培养室内湿度状况控制培养室内湿度状况3.定时器定时器l
15、控制光照时间控制光照时间4.培养架培养架l盛放培养物盛放培养物5.摇床和旋转床摇床和旋转床l进行液体培养时用以改善气体状况进行液体培养时用以改善气体状况小型臭氧发生器小型臭氧发生器不锈钢蒸馏水器（单蒸水）不锈钢蒸馏水器（单蒸水）（一）玻璃器皿（一）玻璃器皿1.培养器皿培养器皿培养用的：试管、三角瓶、培养皿等培养用的：试管、三角瓶、培养皿等2.分注器分注器类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、 量筒漏斗式分注器量筒漏斗式分注器3.其他玻璃仪器其他玻璃仪器烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等（二）器械类（二）器械类1.镊子镊子l
16、类型：枪式镊子（接种、转移）、尖头镊类型：枪式镊子（接种、转移）、尖头镊子（茎尖）子（茎尖）2.剪刀剪刀l类型：大剪刀、小剪刀、弯头剪刀类型：大剪刀、小剪刀、弯头剪刀3.解剖刀解剖刀l类型：固定式和活动式类型：固定式和活动式4.接种针接种针l用来转移细胞或愈伤组织用来转移细胞或愈伤组织5.细菌过滤器细菌过滤器l用来去除细菌（高温的影响）用来去除细菌（高温的影响）1.1.洗涤液的配制洗涤液的配制二、实验基本操作二、实验基本操作（一）洗涤技术（一）洗涤技术A A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用物质，可先用0.5的去污剂洗刷，再用自来水洗的去
17、污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在净，然后浸泡在12盐酸溶液中过夜（不可盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在水冲洗两次，在100120烘箱内烘干备用。烘箱内烘干备用。2.2.洗涤方法洗涤方法 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.50.5的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪
18、器不可烘干）。洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。B B、使用过的玻璃仪器的清洗、使用过的玻璃仪器的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，可先用可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调尿素（用浓盐酸调pH = 1）清洗，接）清洗，接着依次用无离
19、子水、着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，和无离子水清洗，然后用然后用103 mol/L EDTA 除去金属离子的污染，最除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。即可。C、 塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一可以用热洗衣粉水洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。般用酒精擦洗，然后火焰干燥。 E E
20、、除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，、除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用。用。D D、金属用品洗涤、金属用品洗涤1.1.灭菌工作是极其重要的。灭菌工作是极其重要的。 首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴：有菌：有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面，未处理的工具和手等。超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）：高压高温处理（工具
21、、器皿、培养基等） 物理或化学处理；物理或化学处理； 火烤后的物体；火烤后的物体； 健康的动植物不与内外部表面接触的组织健康的动植物不与内外部表面接触的组织 内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但 不会影响培养，也不会污染）不会影响培养，也不会污染）（二）灭菌技术（二）灭菌技术（1 1）物理方法物理方法：干热、湿热、过滤（：干热、湿热、过滤（0.250.25微米）紫外灯、超声波等。微米）紫外灯、超声波等。 （2 2）化学方法化学方法：使用灭菌剂或抗菌素，如：使用灭菌剂或抗菌素，如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双
22、氧水、福尔马林等双氧水、福尔马林等 2.2.灭菌的方法灭菌的方法干热灭菌干热灭菌 玻璃器皿、器械玻璃器皿、器械 湿热灭菌湿热灭菌 培养基、蒸馏水、器械、棉塞等培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌熏蒸灭菌 接种室、培养室接种室、培养室过滤灭菌过滤灭菌 液体培养基、蒸馏水液体培养基、蒸馏水药剂灭菌药剂灭菌 培养材料培养材料烧灼灭菌烧灼灭菌 器械、瓶口、棉塞、包头纸器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌辐射灭菌 接种室。培养间接种室。培养间各种灭菌方法及其使用范围各种灭菌方法及其使用范围适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法：法：150 150 、40min40mi
23、n或或120 120 、120min120min，如，如果发现芽孢杆菌，果发现芽孢杆菌，160 160 、9090120min120min1 1）干热灭菌）干热灭菌适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。棉塞、纸等。121 121 维持维持202030min30min注意点：加足水、排尽气、气压降到注意点：加足水、排尽气、气压降到0 0时，时，才能开盖才能开盖2 2）湿热灭菌）湿热灭菌 培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节
24、剂节剂GA3GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、玉米素等），就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌血清等也需要过滤灭菌 灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，灭菌方法：将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.220.220.450.45微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降微米。制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至至5050左右时，加入适量的激素，然后分装。左右时，加入适量的激素，然后分装。3 3）过滤灭菌）过滤灭菌主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室主要是利用紫外灯进行照射，适合实验室空气、操作台等，灭菌时间空气
25、、操作台等，灭菌时间202030min30min。注意：关灯后注意：关灯后5min5min后再进入。超净工作台后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。关灯后要打开风机。4 4）射线灭菌）射线灭菌用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于用火焰灼烧达到灭菌目的，适用于接种器皿的灭菌。接种器皿的灭菌。5 5）火焰灼烧灭菌）火焰灼烧灭菌适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较6 6）消毒剂）消毒剂长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法：甲甲醛、高锰酸钾熏蒸醛、高锰酸钾熏蒸。 甲醛的用
26、量通常按每立方米空间甲醛的用量通常按每立方米空间2-62-6毫升计算，毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内( (最好在碗或最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗杯下面铺一张报纸，以利清洗) )，然后将甲醛也倒，然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液入碗或杯内，立即出屋关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲分甲醛作用时，由氧化反应产生的热
27、可使其余的甲醛挥发为气体。醛挥发为气体。7 7）熏蒸灭菌）熏蒸灭菌甲醛熏蒸接种室应至少在使用前甲醛熏蒸接种室应至少在使用前2424小时进行，熏蒸后小时进行，熏蒸后密闭保持密闭保持4 4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。鼻有强烈刺激作用。因此，可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前味，减少对人体的
28、刺激作用。使用氨水应在工作前2 2小时进行。小时进行。 对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。人为因素（工作人员本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培养皿：洗培养皿：洗热压热压 玻璃器皿：洗玻璃器皿：洗干热（干热箱）或晾干干热（干热箱）或晾干 接种用具：用接种用具：用CCLCCL4 4布擦布擦湿布擦湿布擦 泡泡75%95%75%95%酒精酒精烧烧培养基：湿热培养基：湿热培培养养材材料料外部细菌：用水冲洗外部细菌：用水冲洗化学药剂处理化学药剂处理 内部细菌内部细
29、菌 茎尖培养茎尖培养 加抗生素：青霉素、利福平加抗生素：青霉素、利福平操作的空气：洗刷地板操作的空气：洗刷地板95%酒精擦超净工作台酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸用化学试剂薰蒸污染来源污染来源（三三）无菌操作技术无菌操作技术1 1. .实验器具和材料的准备实验器具和材料的准备2 2. .用用75%75%的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超的酒精擦拭超净工作台，然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌净工作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意：台。注意：台面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低面上的用品不要放置太多或重叠放置，以免降低灭菌效果。灭菌效果。3 3. .关紫外
30、灯、打开风机，过关紫外灯、打开风机，过5-10min5-10min进入缓冲间，进入缓冲间，以以75%75%洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。洗手和手臂，更换无菌服、帽子和口罩。进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下进入接种室。（注：没有特别情况，尽量不要下工作台）工作台）4 4. .用用70707575的酒精拭擦台面并消毒双手。试验的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。械在其火焰上灼烧，冷却待用。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。注意：所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器
31、械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能金属器械不能过度灼烧，以防退火。移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。能时间太长。5 5. .取流水冲洗（至少取流水冲洗（至少30min30min）过的外植体，用一定）过的外植体，用一定的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗的消毒剂浸泡消毒，用无菌水冲洗3 34 4次，放入无次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。器械进行分离、切割或其他处理。6 6. .打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，打开培养瓶，瓶口在灯焰处
32、旋转灼烧，用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊用镊子将培养材料置于培养基上，灼烧镊子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。子放回，灼烧瓶口，盖上瓶塞。7 7. .用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。作。注意（注意（1 1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。（太快，以防空气流动，增加污染机会。（2 2）不能用）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。取备品更换。 （3 3）为拿取方便，工作台面上的用品）为拿取方便，工作台面上的用品
33、要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。（4 4）工）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用理之前，勿过早暴露在空气中。同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。即封闭瓶口直立可增加落菌机会。（5 5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均）吸取营养液、细胞悬液及其它
34、各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。胞交叉污染。（6 6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。把细菌或支原体带入工作台面发生污染。（7 7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。管丢掉。接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中以免空
35、气中微生物落入瓶中正正 确确 错错 误误整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速迅速正正 确确 错错 误误接种过程中尽可能达到悬空要求防止操作带来的污染防止操作带来的污染正正 确确 错错 误误接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口正正 确确 错错 误误瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口正正 确确 错错 误误接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足正正 确确 错错
36、误误接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中态学上端露于空气中正正 确确 错错 误误第二节第二节 培养基及其配制培养基及其配制主要内容主要内容一、一、 培养基的成分培养基的成分 二、二、 培养基的配制培养基的配制三、三、 常用培养基配方及其特点常用培养基配方及其特点 一、一、 培养基的成分培养基的成分 n水水n无机盐无机盐n炭源和能源炭源和能源 n维生素类维生素类 n氨基酸及有机附加物氨基酸及有机附加物 n植物生长调节物质植物生长调节物质 n琼脂琼脂 n活性炭活性炭 （一）无机营养 无机营养包括水和各种无机盐，它们提供了除碳源以外的
37、几乎所有的营养元素。1.水 是植物原生质的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，为生命活动不可缺少。 配制培养基时一般用离子交换水、蒸馏水、重蒸馏水。2.无机盐无机盐 n无机盐包括大量元素和微量元素。大量元素是指碳、氢、氧、氮、磷、钾、硫、钙、氯、镁。n氮通常是指硝态氮或氨态氮，但在培养基中多以KNO3或Ca（NO3）2的硝态氮形式来满足培养物对氮素的需求，或将两种混合使用，有时也以硝态氮为主，补加（NH4）2SO4以满足酸性植物的需要。n磷是植物的必须元素之一，参与植物生命活动中核酸、蛋白质合成、光合作用、呼吸作用、及能量的贮存、转化与释放等重要生理生化过程，因此在组织培养物中需大量的磷。
38、n钾是主要的阳离子，近年来在培养基中的用量呈逐渐提高的趋势。钙、钠、镁的用量较少。n微量元素是指铁、硼、锰、锌、钴、钼、铜等，其需要量很少，一般多为10-510-7mol.L-1，稍多则产生毒害。 1.碳源(能源) n植物组织培养中被培养的外植体，由于其光合作用的能力较低，需要在培养基中添加一些碳水化合物作为生长发育的能源。一般是添加蔗糖、葡萄糖和果糖，其中以蔗糖为最常用，效果也最好。然而在体细胞组织培养中，葡萄糖、麦芽糖和山梨醇也有影响；在花药培养中，麦芽糖也有促进作用。糖类在培养基中除了作为碳源和能源以外，还具有维持培养基一定的渗透压的作用。大多数植物细胞对蔗糖的需求范围是1%5%，但个别
39、植物组织培养中蔗糖的浓度也可高达7%甚至15%，如玉米、油菜等植物的花药培养。一般来说，蔗糖作为碳源和渗透剂的比例约为3：13：2，即约有1/42/5的蔗糖用于保持培养基的渗透压。 （二）有机成分（二）有机成分2.2.维生素类维生素类 n维生素类与植物体内各种酶的形成有关。维生素的种类很多，在植物组织培养中通常以在植物组织培养中通常以B族族维生素为主，使用浓度一般为维生素为主，使用浓度一般为0.11.0mg/L，其中以盐酸硫胺素（B1）、盐酸吡哆素（B6）、维生素B12、烟酸、生物素和维生素C最为常用。在各种维生素中，Vit.B1可能是必需的。其它可能只对外植体的生长起促进作用。肌醇本身不促进
40、外植体的生长，但可能有助于活性物质发挥作用，从而促进外植体生长、胚状体及芽的形成。培养基中肌醇的用量为50100mg/L。3.3.氨基酸及有机添加物氨基酸及有机添加物 n在一些培养基中可加入一些氨基酸，如甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）等，它们是培养基中重要的有机氮源。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用，常用量为500mg/L。水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）也是多种氨基酸的混合物，对胚状体或不定芽或多胚的分化有良好的促进作用，常用量为500mg/L。 n在
41、某些植物组织培养中还加入一些天然的有机物，例如椰子乳1020%，酵母提取物0.5%，番茄汁510%，香蕉泥100200mg/L，其作用是提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等。如培养基中加入100200mg/L的香蕉泥，具有较大的pH缓冲作用，主要用于兰花的组织培养，对幼苗的发育有较大的促进作用。 （三）（三）植物生长调节物质植物生长调节物质 n生长调节物质是培养基中不可缺少的关键物质，其用量虽极少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用，其中以生长素类和细胞分裂素最为常用。 1 1. .生长素生长素 n它们的主要作用是诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生及试
42、管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽及不定芽的产生。 n生长素常用的是2.4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸），它们作用的强弱顺序为2.4-DNAAIBAIAA。 n2,4-D常用于诱导愈伤组织，NAA、IBA、IAA常用于生根。使用浓度范围一般为0.1mg/l10.0mg/l。2.细胞分裂素细胞分裂素 n它们的主要作用是促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进芽的生长及显著改变其它的激素的作用。 n常用的细胞分裂素类有：激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、2-
43、异戊烯腺嘌呤（2-iP）、吡效隆（4PU，CPPU）和噻重氮苯基脲（TDZ）。 n它们作用的强弱顺序为TDZ 4PU ZT 2-Ip 6-BA KT。但在组织培养中通常使用人工合成的、性能稳定的而价格适中的KT和6-BA，二者的最适浓度为1-10mg/L。n它们作用的强弱顺序为TDZ，4PU ZT 2-Ip 6-BA KT。常用浓度为1-10mg/L。(四) 琼脂n琼脂是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物，它的主要作用是使培养基在常温下凝固，同时不参与代谢，所以在组织培养中一直被作为首选的培养基质而广泛应用。 (五) 活性炭n活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响
44、。例如可以防止酚类物质的污染而引起组织褐化死亡。在兰花组织培养中的效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。 n常用浓度为0.10.5%。二、二、 培养基的配制培养基的配制n准备工作准备工作 n母液的配制和保存母液的配制和保存 n培养基配制程序培养基配制程序培养基配制程序培养基配制程序 1. 水和药品水和药品 n用于配制培养基的水最好是用玻璃容器蒸馏过的蒸馏水 或去离子水；n化学药品应尽可能采用分析纯或化学纯级别的试剂 ；n生长调节物质在应用前有时还需要进行重结晶或选用纯度更高的 ；n蛋白质水解物最好是用酶水解的 ；n药品的称量及定容都要
45、准确 。2. 母液的配制和保存母液的配制和保存n配制培养基最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液，配成培养基配方使用浓度的10倍100倍，甚至1000倍；n在配制母液时为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀 ；n铁盐宜单独配制 ；n对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg/ml较为方便，一般宜配制成0.5mg/ml的母液，这样的浓度既便于计算也可避免冷藏时形成的结晶。 由于多数生长调节物质难溶于水，因此配法各不相同：nIAA，IBA和GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水定容，摇匀后贮于试
46、剂瓶中，贴上标签后存放在冰箱中；NAA可溶于热水或少量95%酒精中，再加水定容至一定体积；n2，4-D不溶于水，可用少量1N的NaOH溶解后，再加水定容；KT和6-BA应先溶于少量1N的HCl中，再加水定容；n玉米素先溶于少量95%的酒精中再加水定容至一定浓度。n椰子汁的活性成分是耐热的，椰子汁从椰子中倒出后应立即煮沸过滤去除蛋白质，高压消毒后贮于-20低温冰箱中备用。 3. 培养基配制程序 三、常用培养基及其特点nMS培养基是1962年Murashige和Skoog为培养烟草材料而设计的。特点是无机盐的浓度高，有加速愈伤组织生长的作用，能满足植物组织对矿质营养的要求。铵盐和硝酸盐含量高，比例
47、也较为合适，也不需要添加更多的有机附加物，这是目前应用的最广泛的一种培养基。与MS较为接近的还有LS、RM、等培养基。nN6培养基是1974年由我国的朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的，其KNO3和（NH4）2SO4高且不含钼。目前在国内已广泛用于小麦、水稻及其它植物的花粉和花药的培养和其它的组织培养。 nB5培养基它的主要特点是含有较低的铵盐，该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用，对有些植物如双子叶植物特别是木本植物更加适合。第三节 外植体的选择与培养外植体的选择外植体的选择 1外植体的灭菌外植体的灭菌 2外植体的接种培养外植体的接种培养3外植体的成苗途径外植体的成苗途径4污染
48、的原因及其预防措施污染的原因及其预防措施 5外植体的褐变及其防止措施外植体的褐变及其防止措施 6培养物的玻璃化现象及其预防措施培养物的玻璃化现象及其预防措施 7一、外植体的选择 n1.选择优良品种n2.选择健壮植株n3.选择最适时期n4.选择适宜的大小n0.51.0cm 二、外植体的灭菌n1.外植体灭菌的流程把采来的材料事先截剪，除去不用的部分将需要的部分仔细弄干净，用流水冲洗肥皂水浸洗 自来水冲洗70%75%的酒精浸泡30s灭菌剂灭菌无菌水冲洗遍35遍接种。n2. 灭菌剂的种类n（1）70%75%酒精n比其他浓度的酒精杀菌效果强，组织穿透力也强。它对材料气泡内空气进行杀菌，可以湿润材料，有利
49、于其他消毒剂的渗入，具湿润和杀菌的双重作用。n酒精灭菌时间不宜过长，浸渍30s可达表面灭菌。因不能彻底杀菌，往往需用其他灭菌剂灭菌。n（2）氯化汞n这是一种重金属化合物 ，有剧毒 。对人、动物和植物的毒性非常大。常用浓度为1%，处理时间510min，杀菌效果好，但残毒很大。外植体灭菌后，需用无菌水冲洗至少35次。n（3）次氯酸钠n浓度可为2%10%，消毒时间1530min，杀菌效果比较好，很容易去除，对植物无害。n（4）漂白粉n这是一种常用的低毒的消毒剂，是含有多种成分的复合化合物，一般含10%20%的次氯酸钙。使用浓度一般为5%10%，或饱和溶液，取其上清液，处理1030min，杀菌效果好，
50、且不伤组织，容易洗净。n（5）次氯酸钙n粉状，可以很好溶解于水，待澄清后取上清液用以消毒，常用浓度为9%10%，消毒时间为530min。次氯酸钙进入植物组织内的速度低于次氯酸钠。由于它易潮解，只能存储有限时间。三、外植体的接种和培养n（一）外植体的接种无菌操作外植体的接种是把经外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的放到无菌培养基上的全部操作过程。全部操作过程。 n1无菌操作n（1）接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； n（2）在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台
