1、DNADNA克隆克隆技术技术目目 录录一、概述一、概述（一）基本概念（一）基本概念 1 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)， 即即无性繁殖无性繁殖。2 动物克隆动物克隆3 杂交杂交目目 录录克隆羊：克隆羊： 个体水平个体水平细胞克隆：细胞克隆： 细胞水平细胞水平DNA克隆：克隆： 分子水平分子水平目目 录录卵细胞C母绵羊子宫母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠目目 录录目目 录录目目 录录5 DN
2、A克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一D N A 分 子 ， 也 称分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D
3、N A (recombinant DNA) 。 目目 录录生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 6 基因工程基因工程(genetic engineering) 实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。目目 录录目目 录录目目 录录（二）重组（二）重组DNA技术的发展史技术的发展史年年 G.J.Mend
4、el的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉目目 录录目目
5、 录录 重组重组DNA医药产品医药产品目目 录录目目 录录（三）重组（三）重组DNA技术技术路线技术技术路线目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 目目 录录二、重组二、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶目目 录录（一）限制性核酸内切酶（一）限制性核酸内切酶1 核酸酶的分类核酸酶的分类2 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是是识别识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其
6、周并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。3 命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录共性共性 （1）只作用于双链）只作用于
7、双链DNA （2）活性有赖于）活性有赖于Mg2+ （3）碱基识别特异性）碱基识别特异性 （4）切口形式）切口形式6 使用原则及注意事项使用原则及注意事项 4 分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口目目 录录n（二）大肠杆菌（二）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶n（三）（三）T4噬菌体噬菌体DNA
8、聚合酶聚合酶n（四）（四）TaqDNA聚合酶聚合酶n（五）反转录酶（五）反转录酶n（六）连接酶（六）连接酶n（七）末端（脱氧核苷酸）转移酶（七）末端（脱氧核苷酸）转移酶n（八）碱性磷酸酶（八）碱性磷酸酶目目 录录 直接从染色体直接从染色体DNADNA中分离中分离 人工合成人工合成 1.601.60元元/ /碱基碱基 基因文库基因文库 反转录反转录PCR PCR mRNA cDNAmRNA cDNA PCR PCR 直接索取直接索取分分目目 录录 （二）（二） 基因载体基因载体定义定义能携带目的基因进入宿主细胞并且在能携带目的基因进入宿主细胞并且在宿主细胞中进行扩增和表达的一类宿主细胞中进行扩增
9、和表达的一类DNA分分子。子。1 载体的种类载体的种类质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目目 录录（1 1）质粒）质粒 (plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息些遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）（2）噬菌体）噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13m
10、p系列系列pUC系列系列目目 录录n（3）病毒载体）病毒载体n（4）粘性质粒）粘性质粒目目 录录2 载体的条件载体的条件n有扩增所需的复制起始点，即能自主复制；有扩增所需的复制起始点，即能自主复制；n有多克隆位点（外源有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点；多个单一酶切位点；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；筛选和鉴定；n表达型载体必须具有指导基因表达的调控元表达型载体必须具有指导基因表达的调控元件。件。目目 录录polylinker目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录AmN2H目目 录录目
11、目 录录目目 录录克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒
12、DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他载体其他载体目目 录录切目目 录录Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCC
13、TAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接
14、情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录 目目 录录 目目 录录目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录目目 录录转目目 录录目目 录录50-100mmol/LCaCl2 目目 录录目目 录录目目 录录筛目目 录录pBR322AmpTet目目 录录AmN2H目目 录录目目 录录 互互补补的的检检测测目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录ACTGAAGGCT目目 录录目目 录录滤膜（固定抗体）
15、+目目 录录目目 录录表目目 录录目目 录录目目 录录 2目的基因在目目 录录目目 录录目目 录录目目 录录 DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一的转化子细胞，再进行扩增提取获得大
16、量同一D N A 分 子 ， 也 称分 子 ， 也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D N A (recombinant DNA) 。 目目 录录重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录目目 录录目目 录录重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录目目 录录
