1、实验三细胞培养细胞计数与转染细胞培养 Cell culture模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 实验三细胞培养细胞计数与转染体外培养细胞的特性n 培养细胞的生长方式 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。实验三细胞培养细胞计数与转染细胞培养基本概念n原代培养原代培养 动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长，在传代之前称为原代培养。n传代传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器
2、皿中。实验三细胞培养细胞计数与转染n细胞系 cell line 原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finite cell line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 n细胞株 cell strain 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。通常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株。 实验三细胞培养细胞计数与转染 实验室常
3、用的细胞培养实验室常用的细胞培养 常用的名称常用的名称组织来源组织来源 Hep-2Hep-2HeLaHeLaA549A549VeroVero HEKHEKCHOCHO 人喉癌人喉癌人子宫颈癌人子宫颈癌人肺癌人肺癌非洲绿猴肾非洲绿猴肾人胚肾人胚肾中国地鼠卵巢细胞中国地鼠卵巢细胞 实验三细胞培养细胞计数与转染 代表性的细胞命名法代表性的细胞命名法 细胞名细胞名称称命名意义命名意义 HeLa为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫-743宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3美国国立卫生研究所（National Institute
4、 of Health）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。实验三细胞培养细胞计数与转染美国已有美国标准细胞库或细胞银行（ATCC）和人遗传突变细胞库（HGMR）、细胞衰老细胞库（CAR）等，其中 ATCC不仅是美国也世界最大的细胞库。ATCC也是世界卫生组织WHO的国际培养细胞文献中心。ATCC现液氮冻存有3200个已经过鉴定的细胞系，其中包括来自正常人和各种疾病患者的皮肤成纤维细胞系和来自不同物种的近75个杂交瘤细胞株。ATCC接纳来自世界各国已经鉴定的细胞予以贮存，同时也向世界各国的研究者或实验室免费提供研究用细胞（做盈利性研究时收费）。 实验三细胞培养细胞计数与转染每代贴附生长细
5、胞的生长过程n游离期n贴壁期n潜伏期n对数生长期n停止期（平台期）实验三细胞培养细胞计数与转染游离期：n细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。n10分钟一4小时实验三细胞培养细胞计数与转染贴壁期：n细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。n底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等n血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。n进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）实验三细胞培养细胞计数与转染实验三细胞培养细胞计数与转染潜伏期n
6、此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。n细胞株潜伏期一般为624小时。实验三细胞培养细胞计数与转染对数生长期：n细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。实验三细胞培养细胞计数与转染停止期（平台期）：n细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n机制：接触抑制、密度依赖性实验三细胞培养细胞计数与转染实验三细胞培养细胞计数与转染细胞培养方式 n群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层n克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞
7、形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 实验三细胞培养细胞计数与转染群体培养（左）和克隆培养（右） 实验三细胞培养细胞计数与转染培养细胞生长的条件n无污染环境: 生物安全柜，超净工作台n基质: 玻璃，塑料n营养需要: 氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统，维生素 (商业化合成培养基) npH: 7.2-7.4n温度: 37 ，细胞培养箱n气体环境 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3-实验三细胞培养细胞计数与转染实验准备实验用品：实验用品：n超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯，甲醛熏蒸
8、器nCO2培养箱n倒置显微镜n酶标仪、微孔板震荡器n液氮罐n自动双重纯水蒸馏器，纯水仪n耗材：培养瓶，吸管，电动移液器，培养板， 冻存管n。实验三细胞培养细胞计数与转染超净台n超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 二级生物安全柜实验三细胞培养细胞计数与转染CO2培养箱n CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 。n 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ，14 h或者紫外杀菌)。 箱内置4-6 L蒸
9、馏水，加入100ml饱和硫酸铜溶液，以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发，并抑制真菌污染。实验三细胞培养细胞计数与转染实验三细胞培养细胞计数与转染 培养瓶实验三细胞培养细胞计数与转染培 养 板实验三细胞培养细胞计数与转染自动双重纯水蒸馏器 纯水仪实验三细胞培养细胞计数与转染酶标仪 微孔板震荡器实验三细胞培养细胞计数与转染滤 器实验三细胞培养细胞计数与转染n实验物品准备 常用玻璃器皿清洗n浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（24小时）、小时）、n流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干烘干实验三细胞培养细胞计数与转染清洁液的配制实验三细胞
10、培养细胞计数与转染细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml实验三细胞培养细胞计数与转染消化液n胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 n胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。n胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。n胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。n用含血清
11、培养液终止其对细胞的消化作用 实验三细胞培养细胞计数与转染培养基n培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。n合成培养基：合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。n人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。实验三细胞培养细胞计数与转染血清中含有：n多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）n多种金属离子n激素n促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等n各种生长因子n转移蛋白n不明成分n一般说来，含5小牛血清
12、的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加 10血清。实验三细胞培养细胞计数与转染n血清质量好坏是实验成败的关键。n常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。n优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。n血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟n血清的消毒：过滤除菌实验三细胞培养细胞计数与转染抗生素的使用n在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。n通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。n庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定实验
13、三细胞培养细胞计数与转染完全培养基的组成n基础培养基 80一95n血清 5一20n碳酸氢钠 2.0 g/Ln青、链霉素 各100单位毫升实验三细胞培养细胞计数与转染培养基的配制 RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。 调节pH值至7.2 加血清（终浓度 10） 实验三细胞培养细胞计数与转染细胞培养基本方法（无菌原则）n无菌工作台用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上。n清洗双手及手腕，戴乳胶手套，然后用75%酒精擦拭。n操作时注意无菌台内空间层次。整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点。手及物品不要在暴露的
14、瓶口上方来往，严格注意无菌操作。实验三细胞培养细胞计数与转染细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。n悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。n半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。n贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。实验三细胞培养细胞计数与转染贴壁生长细胞传代方法n吸光培养瓶中的培养液n加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）n静置2-10 min（显微镜下动态监测）。n加入培养液，终止胰酶消化作用。
15、n用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。n吸取1/3细胞悬液，接种于新的培养瓶内。n加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。n将后者放入培养箱中培养。实验三细胞培养细胞计数与转染细胞冻存和复苏n细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。实验三细胞培养细胞计数与转染冻存和复苏的原则：慢冻快融n当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 n如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。n
16、复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。实验三细胞培养细胞计数与转染慢冻程序n标准程序： 当温度在-25 以上时， 12 /min 当温度达-25 以下时， 510 /min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 细胞冻存器n简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。实验三细胞培养细胞计数与转染低温保护剂的应用n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。n常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞
17、膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。实验三细胞培养细胞计数与转染细胞冻存方法n预先配制冻存液： 含20%血清培养基n 10% DMSO n取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)n加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。实验三细胞培养细胞计数与转染细胞复苏方法n从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。n5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。n低速离心10分钟。n去上清，加新鲜培养
18、液培养刚复苏的细胞。实验三细胞培养细胞计数与转染细胞计数n血细胞计数板n计数仪 Counter 实验三细胞培养细胞计数与转染血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2大正方形，其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。 实验三细胞培养细胞计数与转染培养细胞活力测定台盼蓝法，trypan blue， 利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活
19、细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力实验三细胞培养细胞计数与转染细胞计数 取10ul 细胞悬液，稀释于990ul PBS，取10ul自血球计数盘chamber 上方凹槽加入(已盖上盖玻片），于显微镜下计数 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 对于本次实验，稀释倍数为100，故而细胞浓度为4大方格总数/ 4 x100 x 104 实验三细胞培养细胞计数与转染转染和转化的区别n转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细
20、菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 实验三细胞培养细胞计数与转染转染 (transfection)n转染的定义是“将具生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能”。 n通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。n常特指将质粒或以它们为载体构建的重组子导
21、入真核细胞的过程。 实验三细胞培养细胞计数与转染瞬时转染和稳定转染n瞬时转染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但 通常只持续几天。一般来说，在转染后24-96小时内分析结 果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，-半乳糖苷酶等来帮助检测。n稳定转染，也称永久转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体 （episome）存在。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过选择性标记筛选，如抗生素筛选APH（新霉素抗性基因）， HPH （潮霉素）， TK（胸苷激酶）等反复筛选，得到稳定转染的
22、同源细胞系。 实验三细胞培养细胞计数与转染常用转染技术实验三细胞培养细胞计数与转染影响转染效率的因素n细胞培养物v 健康的细胞v 低的细胞代数（50）能确保基因型不变v 一定的细胞密度v 推荐在转染前24小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能实验三细胞培养细胞计数与转染n血清 v血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。血清质量的变化直接影响转染效率。v有些转染技术如脂 质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。实验三细胞培养细胞计数与转染nDNA质量 v一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果D
23、NA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂盒，能达到两倍2xCsCl梯度离心以上的纯度效果，使DNA质量得到保证。v对一些内毒素敏感的细胞（如原代细胞，悬浮细胞和造血细胞），QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒，在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子，保证理想的转染效果。 实验三细胞培养细胞计数与转染n转染技术 实验三细胞培养细胞计数与转染本次实验背景n腺病毒系统为Microbix Biosystem Inc.公司产品。n将腺病毒骨架质粒pBHG与带有绿色荧光蛋白GFP的穿梭
24、质粒共转染至HEK293细胞，发生同源重组，产生带有外源基因GFP的E1缺失型重组腺病毒，并继而在HEK293细胞中包装成功。 实验三细胞培养细胞计数与转染本次实验转染技术n脂质体转染技术n转染试剂 Invitrogene Lipofectamine 2000实验三细胞培养细胞计数与转染6孔板转染实验步骤n转染前18至24小时内接种2x105细胞至每孔内（细胞浓度1x105/ml，每孔接种2ml，全培养基培养，无抗生素），转染前4小时更换培养基n对每孔细胞，稀释2ug DNA于250 ul OptiMEM n对每孔细胞，稀释4 ul Lipofectamine 2000 into 于250 u
25、l OptiMEM，室温孵育 5 minn将步骤2和步骤3中的DNA悬液和 Lipofectamine 2000 悬液均匀混匀，室温孵育20 min以使 DNA- Lipofectamine 2000复合物形成n将 DNA- Lipofectamine 2000 complexes (500 ul) 直接轻柔的滴加到每孔细胞中，轻柔摇匀实验三细胞培养细胞计数与转染本次实验结果n转染后6小时，可更换培养基，铺上0.5%琼脂糖培养基，以观察病毒空斑的形成n若转染成功，表达GFP的腺病毒成功包装，开始复制，大量复制裂解细胞后，即可在荧光显微镜下观察到细胞内绿色荧光蛋白的表达以及大量细胞外游离的绿色荧光蛋白n普通光镜下可观察到明显的溶细胞性CPE实验三细胞培养细胞计数与转染观察实验结果实验三细胞培养细胞计数与转染
