1、细胞生物学综合性实验动物骨髓细胞染色体标本的制备及动物骨髓细胞染色体标本的制备及NOR的观察的观察 骨髓细胞具有丰富的细胞骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，可直接观质和高度分裂能力，可直接观察到分裂细胞，是研究动物细察到分裂细胞，是研究动物细胞遗传学的好材料。胞遗传学的好材料。细胞生物学综合性实验细胞生物学综合性实验实验目的实验目的n掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术术n观察染色体的数目以及形态特征观察染色体的数目以及形态特征n熟悉银染法显示动物细胞熟悉银染法显示动物细胞NOR的原理和的原理和方法，并了解方法，并了解NOR在细胞中分布情况在细胞中分布情
2、况实验原理实验原理n经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本。便可制作出理想的染色体标本。n银染法可以显示中期染色体上的核仁组织区银染法可以显示中期染色体上的核仁组织区（NOR）。当）。当NOR在间期转录时，产生一种与转录在间期转录时，产生一种与转录活动有关的酸性蛋白，此蛋白可保留至中期并能将活动有关的酸性蛋白，此蛋白可保留至中期并能将染液中的银离子还原为金属银而显现为黑色。所以染液中的银离子还原为金属银而显现为黑色。所以银染法可在中
3、期染色体上显示具有转录活性的银染法可在中期染色体上显示具有转录活性的NOR数目。而且，染色的深黑程度，还可以反应出基因数目。而且，染色的深黑程度，还可以反应出基因的活性高低。的活性高低。实验材料实验材料n小白鼠或青蛙小白鼠或青蛙实验仪器、用具实验仪器、用具n天平天平n离心机离心机n温箱（或水浴锅）温箱（或水浴锅）n显微镜显微镜n酒精灯酒精灯n注射器（注射器（1ml）n解剖盘解剖盘n解剖剪解剖剪n刀片刀片n离心管离心管n吸管吸管n烧杯烧杯n冰冻载玻片冰冻载玻片试剂试剂1nCarnoy固定液（现用现配）固定液（现用现配）甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸=3：1n生理盐水生理盐水n0.1%秋水仙素溶液秋水仙
4、素溶液用生理盐水配制用生理盐水配制n1/15 mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.4）nGiemsa染液染液试剂试剂2n50%硝酸银溶液n氨银溶液：4g硝酸银溶于5ml蒸馏水，再加入5ml浓氨水n3%甲醛溶液：3ml36%甲醛液，加蒸馏水97ml，用4g无水醋酸钠调节pH7，4保存。使用前用甲酸调pH4.5动物染色体制备方法和步骤动物染色体制备方法和步骤n秋水仙素处理秋水仙素处理实验前实验前34h，按动物每克体重，按动物每克体重24g的剂的剂量，腹腔注射秋水仙素量，腹腔注射秋水仙素n收集骨髓细胞收集骨髓细胞处死动物后，立即取出股骨，用刀片剔掉处死动物后，立即取出股骨，用刀片剔掉肌肉，切开
5、股骨两端，用吸有生理盐水的肌肉，切开股骨两端，用吸有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，直至股骨变白色为止。离心管中，直至股骨变白色为止。将收集的骨髓细胞于将收集的骨髓细胞于1000rpm离心离心10min动物染色体制备方法和步骤动物染色体制备方法和步骤n低渗处理低渗处理离心后加入离心后加入600ul蒸馏水，用吸管轻轻吹蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，置打成细胞悬液，置37低渗低渗20min20minn固定固定沿管壁逐滴加入固定液沿管壁逐滴加入固定液600ul600ul，吹打成悬，吹打成悬液，室温固定液，室温固定20min20min，离
6、心。重复此操作，离心。重复此操作一次。最后用一次。最后用500ul500ul固定液将沉淀悬浮。固定液将沉淀悬浮。动物染色体制备方法和步骤动物染色体制备方法和步骤n滴片滴片用镊子取用镊子取预先冰冻预先冰冻的干净载玻片，迅速滴的干净载玻片，迅速滴上上23滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥微微加热干燥nGiemsa染液染色染液染色30min，镜检，镜检注意事项注意事项n低渗处理是实验成败的关键低渗处理是实验成败的关键n处理和操作过程中注意要有利于细胞完处理和操作过程中注意要有利于细胞完整和染
7、色体的伸展、分散整和染色体的伸展、分散作业作业n绘出骨髓细胞分裂中期染色体核型图绘出骨髓细胞分裂中期染色体核型图n指出染色体数目（指出染色体数目（2n）NOR的显示实验步骤的显示实验步骤快速银染法快速银染法( (可选）：可选）： 在染色体标本上滴加含在染色体标本上滴加含1%1%甲酸的甲酸的2%2%明明胶水溶液胶水溶液3 3滴，再加滴，再加50%50%硝酸银硝酸银3 3滴，混合滴，混合后盖上盖片，将标本置于后盖上盖片，将标本置于6060恒温台上处恒温台上处理至液体为棕黄色为止，自来水冲洗，空理至液体为棕黄色为止，自来水冲洗，空气干燥，镜检。气干燥，镜检。NOR的显示实验步骤的显示实验步骤n氨银染
8、色法（建议）氨银染色法（建议）标本上滴加标本上滴加4-8滴滴50%硝酸银溶液，立即覆以盖玻硝酸银溶液，立即覆以盖玻片，放入潮湿密封的培养皿中，片，放入潮湿密封的培养皿中，37温箱中温箱中24-48h，或，或502-5h流水冲去盖玻片，蒸馏水洗流水冲去盖玻片，蒸馏水洗2次，室温晾干次，室温晾干加加4d氨银溶液和氨银溶液和4d3%甲醛溶液（甲醛溶液（pH4.5）于染色）于染色体标本上，立即覆以盖玻片，室温体标本上，立即覆以盖玻片，室温12min流水冲去盖玻片，蒸馏水洗净流水冲去盖玻片，蒸馏水洗净2%Giemsa染色染色10-15min水洗，空气干燥，镜检。水洗，空气干燥，镜检。实验结果实验结果n若
9、染色适中，间期核及染色体为金黄色，油镜若染色适中，间期核及染色体为金黄色，油镜观察，可在某些染色体上看到成对的黑色小点，观察，可在某些染色体上看到成对的黑色小点，此即为银染此即为银染NORNOR（Ag- NORAg- NOR）。）。n若整张片子色淡，间期核及染色体都不易看清，若整张片子色淡，间期核及染色体都不易看清，为染色时间不足，在未滴过香柏油的情况下，为染色时间不足，在未滴过香柏油的情况下，可重新续染。可重新续染。n若染色时间偏长，则染色体为棕色，此时，仍若染色时间偏长，则染色体为棕色，此时，仍可看到黑色的可看到黑色的NORNOR，只是，只是NORNOR与染色体间的反差与染色体间的反差较低。染色严重过度时，整张片子都布满黑色较低。染色严重过度时，整张片子都布满黑色沉淀，这样的标本一般都丢弃不用。若标本珍沉淀，这样的标本一般都丢弃不用。若标本珍贵，也可采用特殊方法褪色后重新染色。贵，也可采用特殊方法褪色后重新染色。注意事项n硝酸银现配现用n银染液可使衣服、皮肤染色，小心操作n3%甲醛工作液pH必须为4.5作作 业业 在油镜下绘制一中期分裂相图在油镜下绘制一中期分裂相图（Ag-NORAg-NOR的位置、数目和形态）。的位置、数目和形态）。思考题思考题n分析你做的标本的优劣，并分析要使实分析你做的标本的优劣，并分析要使实验中的成功应注意哪些问题验中的成功应注意哪些问题
