1、复习复习DNA 重组技术的基本工具有：重组技术的基本工具有：“分子手术刀分子手术刀” “分子缝合针分子缝合针” “分子运输车分子运输车” 限制酶限制酶DNA连接酶连接酶基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体具备了这些工具，基因操作又有哪些程序呢？具备了这些工具，基因操作又有哪些程序呢？2021人人教版（教版（新教材新教材）必修二）必修二 遗传和进化遗传和进化第三章 基因工程第2节 基因工程的基本操作程序具有遗传效应的具有遗传效应的DNADNA片段片段一、目的基因的筛选和获取那么如何筛选合适的目的基因呢？那么如何筛选合适的目的基因呢？一、目的基因的筛选和获取转入转入Bt 抗虫蛋白基因抗虫蛋
2、白基因3. 目的基因的筛选目的基因的筛选一、目的基因的筛选和获取3. 目的基因的筛选目的基因的筛选明确了目的基因后，该怎样获取它呢？ 多聚酶链式反应（简称多聚酶链式反应（简称PCRPCR），在生物体外），在生物体外复制特定复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以获得大片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。量的目的基因。PCR扩增仪扩增仪一、目的基因的筛选和获取3.利用利用PCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因复习：复习：DNA在在细胞内细胞内复制所需复制所需要的条件要的条件条件条件名称名称模板模板双链双链DNA分子分子原料原料4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸能量能量ATP酶酶DNA解旋
3、酶解旋酶DNA聚合酶聚合酶PCR的原理的原理体外体外DNA复制复制多次多次重复重复PCR所需要的条件所需要的条件条件条件名称名称模板模板双链双链DNA分子分子原料原料4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸能量能量加热加热酶酶 DNA聚合酶聚合酶引物引物2种种?热稳定热稳定的的指数指数形式形式 2 2n n 扩增（扩增（n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数） 1 1个个DNADNA分子进行分子进行PCRPCR扩增扩增, ,循环循环4 4次，理论上至少需次，理论上至少需要要（24-1）2=30个引物个引物2（2n-1）过程过程：过程过程：PCR技术与细胞内DNA复制的比较比较项目细胞内DNA复制PCR技术
4、区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所主要在细胞核内细胞外(主要在PCR扩增仪内)酶解旋酶、DNA聚合酶等热稳定的DNA聚合酶（Taq 酶）温度细胞内温和条件控制温度，需在不同温度下进行结果合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因联系模板:均需要脱氧核苷酸双链作为模板原料:均为四种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）酶:均需DNA聚合酶引物:都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成归纳比较归纳比较有关有关PCRPCR技术的说法，不正确的是技术的说法，不正确的是( ( ）A APCRPCR是一项在生物体外复制特定的是一项在生物体外复制特定的DNADNA片
5、段的核酸合成技术片段的核酸合成技术B BPCRPCR技术的原理是技术的原理是DNADNA双链复制双链复制C C利用利用PCRPCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列因的核苷酸序列D DPCRPCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNADNA小试牛刀小试牛刀获取了足够量的Bt基因后，下一步就是要让基因在受体细基因在受体细胞中稳定存在胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时，使Bt基因能够表达和发挥表达和发挥作用这就是需要构建基因表达载体构建基因表达载体。这也是培育转基因抗虫棉的核心工作那么基因表达载体是由哪些
6、部分组成的呢？1.1.基因表达载体基因表达载体的组成的组成a.目的基因目的基因b.启动子启动子c.终止子终止子d.标记基标记基因（因（抗生抗生素抗性基素抗性基因）因）表达特定性状位于基因的首端,是RNA聚合酶结合位点，基因转录的开始位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞e、复制原点：DNA聚合酶结合位点二、基因表达载体的构建（核心）（核心）二、基因表达载体的构建（核心）（核心）质粒质粒DNADNA分子分子限制酶限制酶处理处理一个切口一个切口两个黏性两个黏性末端末端两个切口两个切口获得目的获得目的基因基因DNADNA连连接酶接酶重组重组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒）同
7、一种同一种载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片片段。表达载体在载体基础上增加了段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子目的基因、启动子、终止子三部分结构三部分结构工具酶：工具酶：限制酶、限制酶、DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。必需以表达载体的方式携带进去。【注意】【注意】三、 将目的基
8、因（重组质粒）导入受体细胞为何要把重组质粒导入受体细胞？受体细胞可以分为那些类型？依据他们的结构与功能推测， 导入方法相同吗?如何选择受体细胞，才能让转基因猴全身体细胞都带有目的基因？培育抗虫棉时也必须选用这种细胞吗，为什么？方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法（最多）农杆菌转化法（最多）基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞三、 将目的基因（重组质粒）导入受体细胞农杆菌转化法能有效应用于单子叶植物吗？为什么？据图可知，目的基因发生了
9、几次剪切和拼接？重组Ti质粒跨越了几层细胞膜？T-DNA的T是什么意思？为何要把目的基因接在T-DNA中？将目的基因导入到植物细胞中方法- 农杆菌转化法两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。 将目的基因导入到植物细胞中方法- 农杆菌转化法将目的基因导入到植物细胞中方法- 基因枪法将目的基因导入到植物细胞中方法-花粉管通道法将目的基因导入动物细胞显微注射法导入动物细胞
10、可以用基因枪法吗？常用法常用法：CaCa2+2+处理法处理法常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少（感受态细胞法）（感受态细胞法）受体细胞受体细胞：原核细胞原核细胞将目的基因导入微生物细胞（细菌转化）Ca2+感受态细胞吸收实例：利用转基因大肠杆菌生产药物 原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。生物生物种类种类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细微生物细胞胞农杆菌转化法农杆菌转化法; ;基因枪法、基因枪法、 花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注
11、射法射法CaCa2 2处理处理法法( (感受感受态细胞法态细胞法) )体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞牛刀小试牛刀小试 1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗该抗性基因的主要作用是性基因的主要作用是 ( ) A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B.有利于对目的基因是否导入进行检测有利于对目的基因是否导入进行检测 C.增加质粒分子的增加质粒分子的分子量分子量 D.便于与外源基因连接便于与外源基因连接B2.在遗传工程技术中在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于限制性内切酶主要用于 (
12、)A.目的基因的提取和导入目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合目的基因的提取与载体结合D牛刀小试牛刀小试按前面三个步骤进行了操作，按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？定得到了新的性状？不一定！不一定！如何判断？如何判断？四、 目的基因的检测与鉴定 某种特定性状生物大分子具有特异性 -分子
13、水平的检测特定基因控制特定性状,如抗虫、抗旱等 -性状水平的检测1 1、检测转检测转基因生物的基因生物的DNADNA上上是否插入是否插入目的基因目的基因 首先首先取取出出转基因生物的基因组转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法）方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程: : 将含将含目的基因的目的基因的DNADNA片片段用放射性段用放射性同位素等同位素等作标记作标记, ,以此做以此做探针探针； 使探针和转基因生物的基因组使探针和转基因生物的基因组杂杂交交, ,若若显显示出示出杂交带杂交带, ,表表 明染色体明染色体已插入已插入染色体染色体DNADNA中。中。基因探针基
14、因探针:简称探针，是一段带有检测标记（同简称探针，是一段带有检测标记（同位素、荧光分子或化学发光催化剂），且位素、荧光分子或化学发光催化剂），且顺序顺序已知的，与目的已知的，与目的基因基因互补核酸序列互补核酸序列(DNA或或RNA)。 DNA分子杂交基因探针待测DNA单链DNA或RNA片断，带有某种标记，能与目标DNA或RNA的一条链发生碱基互补配对。 抗原抗体杂交分子杂交（2 2）方法方法: :RNARNA分子杂交分子杂交（3 3）方法方法: :抗原抗体杂交（4 4）个体个体生物学水平生物学水平检测检测怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因没有抗虫基因的棉植株的棉植株有抗虫基因的有抗虫基因的棉植株棉植株棉铃虫棉铃虫虫没有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目的基目的基因表达因表达归纳总结归纳总结基因工程的基本操作流程图谢谢
