1、第第2节节 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序第第3 3章章 基因工程基因工程从社会中来 19971997年，我国政府首次批准商业化种植年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到转基因抗虫棉。到20152015年，我国已育成转年，我国已育成转基因抗虫棉新品种基因抗虫棉新品种100100多个，减少农药用量多个，减少农药用量4040万吨，增收节支社会经济效益万吨，增收节支社会经济效益450450亿元。亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉转基因抗虫棉 非转基因抗
2、虫棉非转基因抗虫棉 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（BtBt抗虫蛋白），破坏抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因杀虫基因”转到棉转到棉花里，让棉花也能产生花里，让棉花也能产生BtBt抗虫蛋白抵抗虫害。抗虫蛋白抵抗虫害。培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与目的基因的筛选与获获取、基因表取、基因表达载体的达载体的构构建、将目的基因建、将目的基因导导入受体细胞、目的基因的入受体细胞、目的基因的检检测与鉴定测与鉴定。基因工程的
3、基本操作程序基因工程的基本操作程序v获：目的基因的筛选与获取v构：基因表达载体的构建v导：将目的基因导入受体细胞v检：目的基因的检测和鉴定（核心）一、目的基因的筛选与获取一、目的基因的筛选与获取 在基因工程的设计和操作中，用于在基因工程的设计和操作中，用于_或或_等的基因就是目的基因，根据不同的需要，等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指目的基因是不同的，主要是指_；1 1. .目的基因概念：目的基因概念：改变受体细胞性状改变受体细胞性状获得预期表达产物获得预期表达产物编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因 与生物与生物抗逆性、抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解、工业用优
4、良品质、生产药物、毒物降解、工业用酶酶等相关的基因等相关的基因例如：例如：2 2. .筛选合适的目的基因：筛选合适的目的基因：（1 1）方法：）方法：从相关的从相关的_和和_的基因中进行筛选的基因中进行筛选已知结构已知结构功能清晰功能清晰 随着随着测序技术测序技术的发展，以及的发展，以及序列数据库（序列数据库（GenBankGenBank）、序列比对序列比对工具（如工具（如BLASTBLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能（2 2）实例：实例：
5、 BtBt抗虫蛋白抗虫蛋白基因基因（BtBt基因）的筛选过程基因）的筛选过程苏云金杆菌（苏云金杆菌（BtBt）制成的生物杀制成的生物杀虫剂虫剂广泛用于防治棉花虫害广泛用于防治棉花虫害对对BtBt基因的基因的表达产物表达产物-Bt-Bt抗虫蛋白抗虫蛋白有较为深入的了解：有较为深入的了解：苏云金杆菌苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（白（BtBt抗虫蛋白），破坏鳞翅目抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫昆虫的消化系统来杀死棉铃虫苏云金杆菌的杀虫作用于苏云金杆菌的杀虫作用于BtBt基因基因有关有关掌握了掌握了BtBt基因的基因的序列信息序列信息BtBt基
6、因是培育转基因是培育转基因抗虫棉较为基因抗虫棉较为合适的目的基因合适的目的基因 当当BtBt抗虫蛋白被抗虫蛋白被分解为多肽分解为多肽后，多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。造成害虫死亡。相关信息相关信息：BtBt抗虫蛋白的抗虫原理：抗虫蛋白的抗虫原理：抗虫棉中的抗虫棉中的BtBt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？ BtBt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中碱性环境中才能表现出毒才能表现出毒性，而人和牲畜的性，而人和牲畜的胃液呈酸性胃液呈酸性
7、，肠道细胞也，肠道细胞也没有特异性受体没有特异性受体，因此，因此，BtBt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响 PCR PCR是是_的缩写，是一项根据的缩写，是一项根据_的原理，在的原理，在_提供参与提供参与DNADNA复制的复制的_与与_，对，对_进行进行_的技的技术；术；3 3. .利用利用PCRPCR获取和扩增目的基因获取和扩增目的基因（1 1）PCRPCR的概念的概念: :聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA半保留复制半保留复制体外体外各种组分各种组分反应条件反应条件目的基因的核苷酸序列目的基因的核苷酸序列大量复制大量复制全称：全称：原理：原理：操作环境：操
8、作环境：目的：目的：优点：优点：聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNADNA半保留复半保留复制制体外（体外（PCRPCR扩增仪扩增仪/PCR/PCR仪）仪）对目的基因的核苷酸序列进行大量复制对目的基因的核苷酸序列进行大量复制可以在短时间内大量扩增目的基因可以在短时间内大量扩增目的基因 PCRPCR由由穆里斯穆里斯等人于等人于19851985年发明，为此，穆年发明，为此，穆里斯于里斯于19931993年获得诺贝年获得诺贝尔化学奖尔化学奖 如果说，沃森和克里克发现如果说，沃森和克里克发现DNADNA双螺旋结构，标志着分子双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么生物学时代的开启，那么PCRPCR技术
9、则标志着分子生物学的腾技术则标志着分子生物学的腾飞飞。PCRPCR技术的出现，彻底变技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等等。遗传学、以及现代医学等等。（2 2）DNADNA复复制制所需的基本条件所需的基本条件: :参与的组分参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用 解旋酶解旋酶DNA母链母链4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物引物提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成合成DNADNA子链的原料子链的原料打开打开DNADNA双链双链催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的
10、33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸（体外用耐高温的（体外用耐高温的DNA聚合酶）聚合酶）（体外用高温代替）（体外用高温代替）（2种）种）引物是一小段能与引物是一小段能与_的一段碱基序列的一段碱基序列_的的_DNADNA母链母链互补配对互补配对短单链核酸短单链核酸3 35 5DNADNA母链母链3 35 5DNADNA母链母链3 35 5引物引物3 35 5引物引物引物引物DNADNA模板模板耐高温的耐高温的DNA聚合酶聚合酶4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸3 35 53 35 53 35 53 35 5变性变性 当温度上升到当温度上升到9090以上以上时，时，双链双链DNADNA解聚为单链
11、解聚为单链复性复性当温度下降到当温度下降到5 500左右左右时，时，两种引物通过两种引物通过碱基互补配对碱基互补配对与两条单链与两条单链DNADNA结合结合延伸延伸当温度上升到当温度上升到7272左右左右时，时，溶溶液中的液中的4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸在在耐高温耐高温的的DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，根据的作用下，根据碱碱基互补配对原则基互补配对原则合成新的合成新的DNADNA链链（3 3）PCRPCR反应过程反应过程条条件件3 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 53 35 5缓冲溶液缓冲溶液（含（含MgMg2+2+) )激活激活真核细胞和
12、细菌的真核细胞和细菌的DNADNA聚合酶聚合酶第一轮循环的第一轮循环的产产物物作为第二轮反作为第二轮反应的应的模板模板，经过，经过变性、复性和延变性、复性和延伸伸三步产生第二三步产生第二轮循环的产物；轮循环的产物；第二轮循环的第二轮循环的产物产物作为第三作为第三轮反应的轮反应的模板模板，经过经过变性、复变性、复性和延伸性和延伸三步三步产生第三轮的产生第三轮的产物；产物；第二轮循环的产物第二轮循环的产物第三轮的产物第三轮的产物完成以后，完成以后，常采用常采用琼琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳电泳来鉴来鉴定定PCRPCR的的产物产物 目的基因目的基因DNA_DNA_后后_，_与单链相应与单链相应互补序列互补
13、序列结合；然后以结合；然后以_为模板在为模板在_作用下进行作用下进行_，即，即将将4 4种种_加到加到_，如此，如此重复循环多次重复循环多次。过程归纳：过程归纳：受热变性受热变性解为单链解为单链引物引物延伸延伸单链单链DNADNADNADNA聚合酶聚合酶引物的引物的3 3端端脱氧核苷酸脱氧核苷酸 由于延伸后得到的由于延伸后得到的_又可以作为下一个循环的又可以作为下一个循环的_，因，因而每一次循环后目的基因的量可以增加而每一次循环后目的基因的量可以增加_，即成，即成_形式扩形式扩增（增（约为约为2 2n n，其中，其中n n为扩增循环的次数）为扩增循环的次数）。产物产物模板模板一倍一倍指数指数每
14、次循环一般可以分为每次循环一般可以分为_、_、_三步。三步。变性变性复性复性延伸延伸用用PCR可以扩增可以扩增mRNA吗吗？mRNAmRNA不可以直接扩增，需要将它不可以直接扩增，需要将它逆转录逆转录成成cDNAcDNA再进行扩增。再进行扩增。1.1.逆转录酶逆转录酶以以RNARNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNARNA互补的互补的DNADNA链链，形成，形成RNA-DNARNA-DNA杂交分子杂交分子；2.2.核酸酶核酸酶H H降解降解RNA-DNARNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNARNA链链，使之变成，使之变成单链单链DNADNA；3.3.以单链以单链DNADNA为模板，在
15、为模板，在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下合成另一条互补的的作用下合成另一条互补的DNADNA链，形成链，形成双链双链DNADNA分子分子，即，即cDNAcDNA 当诱导物存在时，可以当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达激活或抑制目的基因的表达二、基因表达载体的构建（核心）二、基因表达载体的构建（核心）1.1.构建构建基因表达载体的目的：基因表达载体的目的：（1）让目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；）让目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。2.2.基因表达载体的构成基因表达载体的构成终止子终止子
16、启动子启动子目的基因目的基因标记标记基因基因复制复制原点原点基因表基因表达载体达载体（1 1）启动子：）启动子：一段有特殊一段有特殊序列序列结构的结构的_片段片段DNADNA本质：本质：位置：位置： 位于基因的位于基因的_，紧挨，紧挨_上游上游转录的起始位点转录的起始位点功能：功能： RNA RNA聚合酶识别和结合的部位，聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出驱动基因转录出mRNAmRNA诱导型启动子：诱导型启动子：终止子终止子启动子启动子目的基因目的基因标记标记基因基因复制复制原点原点基因表基因表达载体达载体（2 2）终止子：）终止子：本质：本质：一段有特殊一段有特殊序列序列结构的结构的_片
17、段片段DNADNA位置：位置： 位于基因的位于基因的_下游下游功能：功能： 使转录在所需要的地方停下来使转录在所需要的地方停下来（3 3）标记基因：）标记基因：作用：作用： 便于重组便于重组DNADNA分子的筛选分子的筛选（4 4）目的基因：）目的基因：常见类型：常见类型： 抗生素抗性基因、荧光蛋白基因抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等等。如如BtBt基因基因。（5 5）复制原点：）复制原点：使能完成自主复制使能完成自主复制重组重组DNA分子分子限制酶限制酶3 3. .基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程目的基因目的基因限制酶切割位点限制酶切割位点获取目的基因获取目的基因连接酶连接酶基因表
18、达载体构建模式图基因表达载体构建模式图限制酶限制酶启动子启动子限制酶切割位点限制酶切割位点终止子终止子标记标记基因基因复制复制原点原点质粒质粒同种同种限制酶或限制酶或能能产生相同末产生相同末端端的限制酶的限制酶 在构建基因表达载体时，首先会用一在构建基因表达载体时，首先会用一定的定的_切割载体切割载体，使它出现一个，使它出现一个_；然后用；然后用_或或_切割含有目的基因的切割含有目的基因的DNADNA片段片段；再利；再利用用_将目的基因片段将目的基因片段拼接拼接到载体的切口处，这样就形成到载体的切口处，这样就形成了一个重组了一个重组DNADNA分子。分子。 基因表达载体的构建过程：基因表达载体
19、的构建过程：限制酶限制酶切口切口同种限制酶同种限制酶能产生相同末端的限制酶能产生相同末端的限制酶DNADNA连接酶连接酶思考：思考：（1 1）切割载体和切割含有目的基因的切割载体和切割含有目的基因的DNADNA片段为什么要用片段为什么要用同种同种限限制酶或能制酶或能产生相同末端产生相同末端的限制酶的限制酶？产生产生相同的黏性末端或平末端相同的黏性末端或平末端，以便通过，以便通过DNADNA连接酶连接；连接酶连接；（2 2）用）用同一种限制酶同一种限制酶切割切割质粒和含有目的基因的质粒和含有目的基因的DNADNA，再用，再用DNADNA连连接酶接酶处理处理后后，一定会形成，一定会形成符合要求符合
20、要求的重组的重组DNADNA分子吗？分子吗？不一定，载体和目的基因都可能出现不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化或自身连接自身环化或自身连接；目的基因也可能会出现目的基因也可能会出现反向连接反向连接（3 3）如何避免上述问题？如何避免上述问题？ 同时用两种限制酶同时用两种限制酶切割含目的基因的切割含目的基因的DNADNA片段和载体（使得片段和载体（使得目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另目的基因的一端与载体一端的黏性末端相同，而目的基因的另一端与载体另一端的黏性末端相同）一端与载体另一端的黏性末端相同）将生物的所有将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做
21、，直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样效果会怎样？ 这种方法这种方法针对性差针对性差，完全靠运气，也无，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入法确定哪些基因导入了受体细胞了受体细胞常用常用方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法CaCa2+2+处理法处理法三、三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法：花粉管通道法：1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞我国科学家独创我国科学家独创用用_将将_直接注入直接
22、注入_中；中；微量注射器微量注射器含目的基因的含目的基因的DNADNA溶液溶液子房子房在在植物受粉后植物受粉后的一定时间内，的一定时间内，剪去剪去_，将，将_滴加滴加在在_上，使目的基因借助上，使目的基因借助_进入进入_；柱头柱头DNADNA溶液溶液花柱切面花柱切面花粉管通道花粉管通道胚囊胚囊子房子房花粉花粉柱头柱头花粉管花粉管精子精子卵细胞卵细胞胚囊胚囊受体细胞：受体细胞： 受精卵受精卵 将目的基因插入将目的基因插入_中，通过农杆菌的中，通过农杆菌的_作用，就可以使目的基因作用，就可以使目的基因_ 目的基因进入受体细胞内，并且在受目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程体
23、细胞内维持稳定和表达的过程（2）农杆菌转化法农杆菌转化法转化：转化：农杆菌特点：农杆菌特点：a a. .能在自然条件下侵染能在自然条件下侵染_和和_，而对大多数，而对大多数_没有侵染能力；没有侵染能力；双子叶植物双子叶植物裸子植物裸子植物单子叶植物单子叶植物b.b.农杆菌细胞内含有农杆菌细胞内含有_，当它侵染植物细胞后，能将，当它侵染植物细胞后，能将_上的上的_（_）转移转移到到被侵染的细胞，并被侵染的细胞，并且将其且将其_；TiTi质粒质粒TiTi质粒质粒T-DNAT-DNA可转移的可转移的DNADNA整合到该细胞的染色体整合到该细胞的染色体DNADNA上上利用农杆菌进行转化的思路：利用农杆
24、菌进行转化的思路：TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA转化转化进入植物细胞进入植物细胞农杆菌转化法的过程：农杆菌转化法的过程：T-DNAT-DNA目的基因目的基因构建表达载体构建表达载体含目的基因的含目的基因的重组重组TiTi质粒质粒转入农杆菌转入农杆菌含重组含重组TiTi质粒的质粒的农杆菌农杆菌导入植物细胞导入植物细胞表现出新性状的植物表现出新性状的植物植物细胞植物细胞将目的基因插将目的基因插入染色体入染色体DNADNA中中植物组植物组织培养织培养转化的具体方法：转化的具体方法：a.a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片_，然后然后_，并，并_；受体细胞
25、为受体细胞为_与农杆菌共培养与农杆菌共培养筛选转化细胞筛选转化细胞再生成植株再生成植株体细胞体细胞b.b.可以将可以将_直直接浸没接浸没在在_中一段时间，然后中一段时间，然后培养培养植株并植株并获得获得_，再进行，再进行_、_等；等；受体细胞为受体细胞为_花序花序含有农杆菌的溶液含有农杆菌的溶液种子种子筛选筛选鉴定鉴定受精卵受精卵2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射法显微注射法（1）受体细胞：）受体细胞： 受精卵受精卵。 ( (因为受精卵容易表现出全能性因为受精卵容易表现出全能性) )（2）过程：）过程：2022-1-11构建基因表达载体构建基因表达载体并并提纯提纯利用利用
26、显微注射显微注射将基因表达将基因表达载体注入动物的载体注入动物的受精卵受精卵中中早期胚胎培养早期胚胎培养胚胎移植胚胎移植获得获得具有新性状的动物具有新性状的动物3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞CaCa2+2+处理处理法法（1）受体细胞：）受体细胞： 常用常用原核生物原核生物作为受体细胞，其中以作为受体细胞，其中以大肠杆菌大肠杆菌最最广泛广泛（2）原核生物的优点原核生物的优点: : 繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养易于培养（3）一般过程）一般过程: :2022-1-11CaCa2+2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌使细胞处于一种使细胞处于
27、一种能吸收周围能吸收周围环境中环境中DNADNA分子的生理状态分子的生理状态将重组的将重组的基因表达载体导入基因表达载体导入其中其中CaCa2+2+的作用：增加细胞壁的通透性的作用：增加细胞壁的通透性这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞 检查检查目的基因目的基因进入受体细胞后，进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其是否稳定维持和表达其遗传特性；遗传特性；四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定1 1. .目的目的: :2.2.检测内容及检测内容及方法方法: :类型类型检测内容检测内容方法方法分子水平的分子水平的检测检测个体生物学个体生物学水平的鉴定水平的鉴定受体细胞的染色体受体细
28、胞的染色体DNADNA上是上是否插入了目的基因否插入了目的基因目的基因是否转录出了目的基因是否转录出了mRNAmRNAPCRPCR等技术等技术目的基因是否翻译成蛋白质目的基因是否翻译成蛋白质抗原抗原- -抗体杂交技术抗体杂交技术个体是否具有相应性状个体是否具有相应性状病原体接种实验等病原体接种实验等 个体生物学水平的鉴定具体方法举例个体生物学水平的鉴定具体方法举例转基因生物转基因生物鉴定方法鉴定方法成功标志成功标志抗虫植物抗虫植物抗病毒（菌）植物抗病毒（菌）植物抗盐植物抗盐植物抗除草剂植物抗除草剂植物获取目的基因产物的获取目的基因产物的转基因生物转基因生物饲喂害虫（抗虫接种实验饲喂害虫（抗虫接
29、种实验）害虫死亡害虫死亡病毒（菌）接种实验病毒（菌）接种实验未染病未染病盐水浇灌盐水浇灌正常生长正常生长喷洒除草剂喷洒除草剂正常生长正常生长提取细胞产物与天然产品进提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较行功能活性比较功能、活性功能、活性正常正常到社会中去1.1.在实际种植过程中，棉铃虫是否对转在实际种植过程中，棉铃虫是否对转BtBt基因的抗虫棉产生了严重基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？的抗性？证据是什么？ 科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，20112011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中年的数据显示，大部
30、分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；抗及高抗水平；20132013年的数据表明，年的数据表明，如果棉田周围存在大量天如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转BtBt基因的抗虫基因的抗虫棉产生明显抗性。棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。基因抗虫棉品种。2 2. .科研工作者在没有发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应科研工作者在没有发现棉铃虫
31、出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对对。他们想出的延缓棉铃虫对BtBt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？这些措施的原理是什么？有效吗？ 科研人员想出的延缓棉铃虫对科研人员想出的延缓棉铃虫对BtBt抗虫蛋白产生抗性的措施抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。有很多，主要可以分为以下几个方面。（1 1）基因策略。）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组虫性和抗虫持久性。包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建
32、组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种早种植的抗虫棉中只转入了一种BtBt基因，抗性比较单一；现在基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的经常将两种或两种以上的BtBt基因基因( (如如CrylAaCrylAa和和CrylAcCrylAc基因基因) )同时同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。范围。（2
33、2）田间策略。）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基的措施是在转基因棉田中，总面积的因棉田中，总面积的4%4%种植不使用任何杀虫剂的种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%20%30%30%面积的可使用面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植棉田周围至少种植5
34、5行或者行或者20%20%面积的非转基因棉花。我国除新疆面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度( (如将转基因抗虫棉与如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作) )，这这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。庇护所。 这样做的原理是这样做的原理是为少部分害虫提供一
35、个正常的取食环境，为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持始终保持一一定的敏感目标害虫种群。定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。（3 3）国家宏观调控策略国家宏观调控策略。该策略包括。该策略包括实施分区种植管理、加强实施分区种植管理、加强抗性监测、抗性监测、 进行严格的安全生评价进行严格的安全生评价等。等。DNADNA片段的扩增及电
36、泳鉴定片段的扩增及电泳鉴定一、实验原理实验原理1 1. .利用利用PCRPCR在体外进行在体外进行DNADNA片段扩增的原理片段扩增的原理PCRPCR利用了利用了DNADNA的的_原理，通原理，通过过_来控制来控制DNADNA双链的解聚双链的解聚与结合与结合，PCRPCR仪实质上就是一台能够仪实质上就是一台能够_的仪器的仪器，一次一次PCRPCR一般一般要经历要经历_次循环；次循环；热变性热变性调节温度调节温度自动调控温度自动调控温度3030PCRPCR扩增扩增DNADNA片段还利用了片段还利用了_的原理；的原理；DNADNA半保留复制半保留复制2.DNA2.DNA片段电泳鉴定的原理片段电泳鉴
37、定的原理DNADNA分子具有分子具有_，在一定，在一定的的_下，这些基团可以带上下，这些基团可以带上正电荷或负正电荷或负电荷电荷，在在_的作用下，这些的作用下，这些_会会向着向着_的的电极电极移动移动，这个过程就是这个过程就是_；可解离的基团可解离的基团pHpH电场电场带电分子带电分子电泳电泳与它所带电荷与它所带电荷相反相反PCRPCR的产物一般通过的产物一般通过_来鉴定来鉴定；在凝胶中在凝胶中DNADNA分子的迁移速率与分子的迁移速率与_、_和和_等有关等有关凝胶中的凝胶中的DNADNA分子通过分子通过_，可以在波长为，可以在波长为_的的_下被检测出来下被检测出来。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电
38、泳凝胶的浓度凝胶的浓度染色染色300nm300nm紫外灯紫外灯DNADNA分子的大小分子的大小构象构象二、材料用具材料用具PCRPCR仪（自动控温，实现仪（自动控温，实现DNADNA的扩增）的扩增）微量离心管（实际上是进行微量离心管（实际上是进行PCRPCR反应的场所）反应的场所）微量移液器（用于向微量离心管转移微量移液器（用于向微量离心管转移PCRPCR配方中的液体）配方中的液体）一次性吸液枪头（微量移液器一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）吸取一种试剂更换一次枪头）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）1010倍浓缩的倍浓缩的扩增缓冲液扩增缓冲液（
39、含（含MgMg2+2+）5L5L20mmol/20mmol/L L的的4 4种脱氧核苷酸的等量混合液种脱氧核苷酸的等量混合液（实为（实为dNTPdNTP）1 1LL2020 mol/Lmol/L的引物的引物2.52.5LL2020 mol/Lmol/L的引物的引物2.52.5LLH H2 2O O28283333LL1-5U/1-5U/ L L的的Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶（即耐高温的（即耐高温的DNADNA聚合酶）聚合酶）1 12U2U模板模板DNA DNA （用量为（用量为1pg-1g1pg-1g）5 51010LL总体积总体积5050LLPCRPCR反应体系的配方反应体系的
40、配方4 4种脱氧核苷酸等量混合液、种脱氧核苷酸等量混合液、2 2种引物、种引物、TaqDNATaqDNA聚合酶、模板聚合酶、模板DNADNA、扩增缓冲液、无菌水。扩增缓冲液、无菌水。电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 使使DNADNA充分变性，以利于引充分变性，以利于引物更好地和模板结合。物更好地和模板结合。三、方法步骤方法步骤DNADNA片段的扩增片段的扩增1 1、移液：、移液：用用微量移液器微量移液器按照按照PCRPCR反应体系配方或反应体系配方或PCRPCR试剂盒的说试剂盒的说明书明书，在，在微量离心管微量离心管中依次加入各组分中
41、依次加入各组分2 2、离心：、离心： 待所有组分都加入后，待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子盖严离心管的盖子，将微量离，将微量离心管心管放入离心机放入离心机里，离心约里，离心约10s10s，使反应液集中在离心使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）管的底部（提高反应速率）3 3、反应：、反应： 参照下表的参数，参照下表的参数，设置好设置好PCRPCR仪的循仪的循环程序环程序。将装有。将装有反应液的反应液的微量离微量离心管放入心管放入PCRPCR仪中仪中进行反应。进行反应。循环程序循环程序变性变性复性复性延伸延伸预变性预变性94,5min94,5min/ / /3030次次9494,30s,
42、30s5555,30s,30s7272,1min,1min最后一次最后一次9494,1min,1min5555,30s,30s7272,1min,1min预变性：预变性：DNADNA片段的电泳鉴定片段的电泳鉴定1 1、配制琼脂糖溶液、配制琼脂糖溶液 根据待分离根据待分离DNADNA片段的片段的大小大小，用，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制一般配制质量体积比质量体积比0.8%-1.2%0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波沸水浴或微波炉炉内内加热至琼脂糖熔化加热至琼脂糖熔化。稍冷却稍冷却后，加入适量的后，加入适量的核酸染料核酸染料混匀混匀2 2
43、、制备凝胶、制备凝胶将将温热温热的琼脂糖溶液的琼脂糖溶液迅速迅速倒入模具，并插入合适大小的倒入模具，并插入合适大小的梳子梳子，以形成以形成加样孔加样孔。将将电泳缓冲液电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶没过凝胶1mm1mm为宜为宜待凝胶溶液待凝胶溶液完全凝固完全凝固，小心，小心拔出梳子拔出梳子，取出，取出凝胶放入电泳槽凝胶放入电泳槽内。内。3 3、加样、加样 将扩增得到的将扩增得到的PCRPCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合混合，再用，再用微量移液器微量移液器将将混合液缓慢注入凝胶的加样孔混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。内。
44、留一个加样孔留一个加样孔加入加入指示分子大小的标准参照物指示分子大小的标准参照物4 4、电泳、电泳 接通电源，根据电泳槽接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离阳极至阴极之间的距离来设定电来设定电压，压，一般为一般为1 15V/cm5V/cm。待。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，时，停止电泳停止电泳5 5、观察记录、观察记录取出凝胶置于取出凝胶置于紫外灯下紫外灯下观察和照相观察和照相注意注意1 1. .为为避免外源避免外源DNADNA等因素的污染等因素的污染，PCRPCR实验中使用的微量离心实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行管、枪头和蒸馏水等在使用
45、前必须进行高压灭菌高压灭菌处理。处理。2.2.该实验所需材料可以直接从公司购买，该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装缓冲液和酶应分装成小份成小份，并在，并在-20-20储存储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上放在冰块上缓慢融化缓慢融化。3.3.在向微量离心管中添加反应组分时，在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换移液器上的枪头都必须更换。4.4.在进行操作时，一定要在进行操作时，一定要戴好一次性手套。戴好一次性手套。5.PCR5.PCR扩增扩增不能随意加大不能随意加大试剂用量。试剂用量
46、。四、结果分析与评价结果分析与评价1 1. .你是否成功扩增出你是否成功扩增出DNADNA片段？判断的依据是什么？片段？判断的依据是什么？2.2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。这个结果的可能原因。 可以在紫外灯下直接观察到可以在紫外灯下直接观察到DNADNA条带条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为段大小约为750bp750bp。 如果扩增不成功，可能的原因有：如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了漏加了PCRPCR的反应成分，各的反应成分，各反应成分的用量不当，反应成分的用量不当，PCRPCR程序设置不当等。程序设置不当等。如果扩增结果不止一如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNADNA聚合酶的质量不好等聚合酶的质量不好等。
